低温等离子体处理对采后黄花菜活性氧代谢和品质的影响

马晓艳，王 娟，张海红，王 通，高 坤

（宁夏大学食品与葡萄酒学院，宁夏 银川 750021）

黄花菜（daylily），又称金针菜、忘忧草，为百合科萱草属，多年生草本植物，兼食用、药用、观赏价值于一体，是我国特色蔬菜之一[1-2]。黄花菜营养丰富，含有糖类、蛋白质、维生素及多种人体必需氨基酸[3]，属菜中珍品。目前，市场上干制是黄花菜主要的贮藏、销售及食用方式[4]。尽管鲜黄花菜口感清脆、鲜甜味美，但因其易失水，耐贮性差，采后易腐烂变质而影响其商品货架期[5]。因此，选择合适的保鲜方式减缓黄花菜采后生理活动，延长其货架期，已成为了亟待解决的问题。

等离子体被称为物质的第4种状态，由游离电子、离子、反应原子、中性分子和光子组成[6]。低温等离子体技术因其具有可有效杀灭或减少农产品表面的微生物、降解代谢产物和农药残留等作用[7-8]，而成为一种新兴的非热食品杀菌技术[9]。低温等离子体可电离果蔬周围介质，产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）、活性氮、紫外光子、带电粒子等多种具有反应活性的杀菌物质，作用于微生物细胞的各个部位，蚀刻细胞、引起细胞膜穿孔、大分子氧化，从而造成细胞的破坏或死亡[10]。Misra等[11]研究发现，将草莓经5 min低温等离子体处理后，背景菌群中的需氧嗜温菌、酵母和霉菌在处理后的24 h内减少了2（lg（CFU/g）），等离子体处理可有效抑制微生物引起的腐烂变质。

低温等离子体在处理过程中由于高能粒子和自由电子相互碰撞等因素，会产生大量的ROS[12]，ROS包括H2O2、超氧阴离子、超氧阴离子自由基、羟自由基（hydroxyl free radical，·OH）等[13-14]。尽管ROS对微生物杀菌起到积极的效果，但是能否引起果蔬植物细胞ROS代谢失衡及品质劣变，还有待于进一步探讨。通常情况下，采后果蔬在贮藏过程中，通过超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、过氧化物酶（peroxidase，POD）等ROS清除酶系统和非酶清除系统可保持ROS代谢动态平衡。然而高温、重金属、机械损伤和微生物侵染等逆境胁迫果蔬时，会破坏ROS代谢动态平衡，导致ROS积累过多，产生有毒有害的丙二醛（malondialdehyde，MDA），使细胞膜发生膜脂过氧化，加速细胞的衰老，加快果蔬的腐败变质[15]。任翠荣等[16]研究发现常压低温等离子体处理距离10 mm、电压为140 V、气体流速1 L/h处理草莓60 s，贮藏5 d后，与对照组相较，草莓的质量损失率显著降低，维生素含量显著高于对照组，草莓的常温保鲜期延长了2 d；王卓等[17]研究表明利用介质阻挡放电低温等离子体在45 kV工作电压下处理‘灿烂’蓝莓50 s，蓝莓表面细菌和真菌数量分别下降了1.75（lg（CFU/g））和1.77（lg（CFU/g）），与对照组相比，低温等离子体处理抑制了蓝莓的硬度和VC含量的下降，提高了蓝莓SOD、CAT、POD等抗氧化酶的活性，促进超氧阴离子自由基的清除，花青素和总酚含量在贮藏初期略有下降，但对总抗氧化能力无显著影响，同时可提高多酚氧化酶活力，促进蓝莓酚类氧化形成醌类，促进木质素合成。

本研究拟利用介质阻挡放电等离子体设备对鲜黄花菜进行处理，探讨低温等离子体处理过程中产生的ROS等活性成分对黄花菜贮藏过程中的ROS代谢平衡以及品质的影响，为低温等离子体在黄花菜保鲜中的应用、黄花菜保鲜新技术及装备的开发提供理论依据，以期推动黄花菜产业的发展。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

‘大乌嘴’黄花菜采自宁夏吴忠市红寺堡区太阳山镇清泉合作社，挑选九成熟、长9～12 cm、单根质量8～10 g、直径0.8～10.0 mm、无病虫害、无机械损伤的花蕾。

无菌双蒸水 北京雷根生物技术有限公司；无水乙醇（分析纯） 天津市北联精细化学品开发有限公司；冰乙酸（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；生理盐水 山东齐都药业有限公司；蛋白（total protein，TP）测定试剂盒、总超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）测定试剂盒、CAT测定试剂盒、POD测定试剂盒、H2O2测定试剂盒、MDA测定试剂盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

低温等离子体冷杀菌设备 南京苏曼科技公司；PQ 001型台式脉冲核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）分析仪 上海纽迈电子科技有限公司；SQP电子天平赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；TGL-16M高速冷冻离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司；752N紫外-可见分光光度计 上海悦丰仪器仪表有限公司；HH-1数显恒温水浴锅 金坛市江南仪器厂；DDS-307A电导率仪 上海仪点科学仪器股份有限公司；维生素C测定仪 杭州陆恒生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黄花菜预处理

选择聚酯（polyester，PET）保鲜盒对黄花菜进行包装，使用聚乙烯（polyethylene，PE）进行拉伸裹包，包装10 盒，每盒50 g，随机挑选5 盒进行低温等离子体处理，剩下5 盒为对照样品。依据前期预实验结果，设置低温等离子体处理参数为：放电电压110 kV、放电频率110 Hz、处理时间150 s、处理距离7.5 cm。处理后的黄花菜置（4±1）℃下贮藏。贮藏期间每3 d测定黄花菜的可溶性蛋白、H2O2和MDA含量以及ROS清除酶活力等。

1.3.2 抗氧化酶活力的测定

酶液的提取：准确称取1 g黄花菜组织，按照1∶9（m/V）的比例加入生理盐水，冰水浴条件下制备成质量分数10%的组织匀浆液，匀浆液在4 ℃条件下3 500 r/min离心10 min，取上清液测定。

POD、SOD、CAT活力均采用试剂盒进行测定，具体操作按照试剂盒说明书进行，结果均以蛋白质量计。

1.3.3 H2O2和MDA含量测定

H2O2和MDA含量的测定均采用试剂盒完成，结果均以蛋白质量计。

1.3.4 相对电导率的测定

相对电导率的测定参照李合生[18]的方法，略作修改。选取黄花菜最外层叶子，剪成1 cm叶片，称取5.0 g叶片，蒸馏水冲洗后用滤纸吸干水分。将叶片放入烧杯中，加入50 mL蒸馏水后在25 ℃的环境中静置1 h，测定溶液的电导率（P1/（μS/cm））。将烧杯置于沸水浴中煮沸15 min，取出冷却至室温后测定此时的电导率（P2/（μS/cm））。相对电导率按下式计算。重复测定3 次，计算平均值。

1.3.5 可溶性蛋白含量的测定

可溶性蛋白含量的测定基于考马斯亮蓝试剂盒完成。

1.3.6 总可溶性固形物（total soluble solid，TSS）质量分数的测定

取10 g黄花菜捣碎，用两层纱布过滤，将滤液搅拌均匀，使用手持阿贝折光仪测定TSS质量分数，重复测定3 次，取平均值。

1.3.7 VC含量的测定

取10 g黄花菜，打碎均质后，使用VC测定仪测定VC含量，重复测定3 次，取平均值。

1.3.8 色度a*值测定

参考姚亚明[19]的方法，采用便携式色差仪对黄花菜每片花瓣表皮中部测定，每个黄花菜测定3 次，重复测定3 次，取平均值。a*表示红绿度，正值代表红色，负值代表绿色。

1.3.9 水分分布的测定

利用PQ 001型台式脉冲核磁共振分析仪进行测定。采用自旋回讯磁振脉冲序列，得到自由诱导指数衰减曲线，对曲线进行反演操作，得到T2图谱。

1.4 数据处理与分析

各指标均重复测定3 次，数据以平均值±标准差表示，采用SPSS 26软件进行数据统计分析，差异显著性采用邓肯多重比较检验，P＜0.05表示差异显著，并采用Origin Pro 2019软件作图。

2 结果与分析

2.1 低温等离子体处理对采后黄花菜ROS清除酶活力的影响

植物体内ROS的含量主要通过活力ROS清除酶和内源抗氧化物质来调节。活力ROS清除酶主要包括SOD、CAT、POD等[20]。

SOD在高等植物的所有部位几乎都存在，分布于叶绿体、线粒体中，其主要作用是催化植物组织内的超氧阴离子变为H2O2[21]。由图1可知，随贮藏时间的延长，SOD活力呈先上升后下降的趋势，在贮藏3～9 d内，处理组SOD活力一直高于对照组，处理组和对照组均在第9天达到峰值，在贮藏9～15 d内，对照组SOD活力高于处理组，第15天时，处理组SOD活力显著低于对照组（P＜0.05）。由此可知，贮藏前期，低温等离子体处理可以诱导黄花菜在SOD活力增加，但二者之间差异不显著（P＞0.05）。

图1 低温等离子体处理对采后黄花菜SOD活力的影响Fig. 1 Effect of cold plasma treatment on SOD activity of postharvest daylily

CAT主要存在于过氧化氢体中，能够催化H2O2分解为H2O和O2，从而有效消除ROS[22]。由图2可知，在贮藏0～3 d内，处理组和对照组CAT活力均呈上升趋势，二者均在第3天出现第一次峰值，此时处理组CAT活力为2.22 U/mg，是对照组的1.91 倍，显著高于对照组（P＜0.05），在贮藏12 d时，处理组达到第二次峰值，为2.26 U/mg,，是此时对照组的2.97 倍，差异显著（P＜0.05），第15天，对照组CAT活力显著大于处理组（P＜0.05）。由此可知，低温等离子体处理诱导并显著提高了贮藏期间的黄花菜CAT活力。

图2 低温等离子体处理对采后黄花菜CAT活力的影响Fig. 2 Effect of cold plasma treatment on CAT activity of postharvest daylily

由图3可知，处理组和对照组POD活力0～3 d内均下降，处理组POD活力在第6天达到了峰值，为321 U/mg，是此时对照组的3.56 倍，这可能是为了应对ROS水平的升高，黄花菜组织中的抗氧化机制被触发，黄花菜处于氧化应激状态，POD活力增大。对照组POD活力则在贮藏0～12 d内缓慢下降，第15天，略微上升，在贮藏期内，处理组POD活力均高于对照组，且在贮藏第6、9、15天，处理组均显著高于对照组（P＜0.05）。进一步可知，低温等离子体处理可提高POD活力，这可能是由于低温等离子体放电产生的ROS作为信号转导分子，诱导了黄花菜POD活力的增加。

图3 低温等离子体处理对采后黄花菜POD活力的影响Fig. 3 Effect of cold plasma treatment on POD activity of postharvest daylily

2.2 低温等离子体处理对采后黄花菜H2O2含量的影响

植物细胞正常代谢过程中产生的ROS，包括羟自由基、超氧阴离子和H2O2。浓度较低的H2O2可在植物生长发育过程中作为信号转导分子起到重要的调控作用[23]。然而，当果蔬植物组织中的H2O2含量超过一定阈值时，H2O2会影响其ROS代谢平衡，从而毒害细胞。由图4可知，随贮藏时间的延长，处理组和对照组H2O2含量均呈先上升后下降的趋势，其中处理组H2O2含量在贮藏期间始终低于对照组，但二者差异不显著（P＞0.05）。相比对照组，低温等离子体处理并未造成黄花菜ROS代谢失衡，过多积累H2O2，这可能是因为低温等离子体处理提高了抗氧化酶活性，及时清除了黄花菜组织中的ROS。

图4 低温等离子处理对采后黄花菜H2O2含量的影响Fig. 4 Effect of cold plasma treatment on hydrogen peroxide (H2O2)content of postharvest daylily

2.3 低温等离子体处理对采后黄花菜MDA含量的影响

MDA是果蔬采后膜脂过氧化的主要产物之一，其含量可间接衡量植物细胞受损程度[24]。由图5可知，随着贮藏时间的延长，处理组和对照组MDA含量均呈明显上升的趋势，且对照组在贮藏后期达到了较高水平，说明膜脂严重过氧化。贮藏初期，黄花菜MDA含量仅为0.41 nmol/mg，贮藏第3天，处理组MDA含量为0.51 nmol/mg，对照组MDA含量为1.16 nmol/mg，是处理组的2.27 倍，处理组MDA含量显著低于对照组（P＜0.05），说明对照组膜脂氧化程度较高；在贮藏过程内，处理组的MDA含量始终显著低于对照组（P＜0.05）。由此可知，低温等离子体处理可有效减少采后黄花菜MDA的累积，降低鲜黄花菜采后膜脂过氧化的程度，较好地保持黄花菜细胞膜完整性，延缓黄花菜采后的衰老变质。

图5 低温等离子体处理对采后黄花菜MDA含量的影响Fig. 5 Effect of cold plasma treatment on MDA content of postharvest daylily

2.4 低温等离子体处理对采后黄花菜细胞膜透过率的影响

由图6可知，随贮藏时间延长，细胞膜相对电导率均呈逐渐上升的趋势。在贮藏第6天，处理组的细胞膜相对电导率显著高于对照组（P＜0.05）；在贮藏6～15 d内，处理组的细胞膜相对电导率均极显著高于对照组（P＜0.01）。由此可知，低温等离子体处理可以减缓细胞膜相对电导率的增加，从而使黄花菜细胞膜保持完整性。这可能是因为低温等离子体处理同时具有杀菌和提高黄花菜抗氧化酶活性的作用[25]，这两者的协同作用避免了黄花菜细胞膜结构被微生物侵染，从而保持了细胞膜的透过性，减缓了黄花菜采后的生理活动，提高了黄花菜的采后品质。

图6 低温等离子体处理对采后黄花菜细胞膜透过率的影响Fig. 6 Effect of cold plasma treatment on cell membrane permeability of postharvest daylily

2.5 低温等离子体处理对采后黄花菜可溶性蛋白含量的影响

由图7可知，随贮藏时间的延长，可溶性蛋白含量总体呈下降趋势，可能是因为发生了水解[26]。但是贮藏第3天，处理组黄花菜的可溶性蛋白含量高达16.38 mg/g，而对照组快速下降至10.8 mg/g，差异显著（P＜0.05），这可能是因为低温等离子体处理会抑制采后黄花菜蛋白水解酶活性，从而提高了可溶性蛋白的积累。贮藏后期，处理组可溶性蛋白保持较高水平，但二者差异不显著（P＞0.05）。由此可知，低温等离子体处理可延缓鲜黄花菜可溶性蛋白的降低，从而提高黄花菜细胞的保水性，对细胞膜起到保护作用，使黄花菜保持较好的营养价值。

图7 低温等离子体处理对采后黄花菜可溶性蛋白含量的影响Fig. 7 Effect of cold plasma treatment on soluble protein content of postharvest daylily

2.6 低温等离子体处理对采后黄花菜TSS质量分数的影响

TSS主要以可溶性糖类为主，是果蔬自身呼吸代谢活动的主要能量来源，其质量分数是反映果蔬成熟度和贮藏品质的重要指标[27]。由图8可知，随贮藏时间的延长，TSS质量分数总体呈先升高再下降趋势。在贮藏期间，处理组与对照组TSS质量分数差异不显著（P＞0.05），由此可知，低温等离子体处理对采后黄花菜的TSS质量分数变化无明显影响。

图8 低温等离子体处理对采后黄花菜TSS质量分数的影响Fig. 8 Effect of cold plasma treatment on soluble solid content of postharvest daylily

2.7 低温等离子体处理对采后黄花菜VC含量的影响

VC是黄花菜中重要的营养成分，其含量也是衡量鲜黄花菜品质的重要指标。由图9可知，随贮藏时间延长，采后黄花菜的VC含量均呈逐渐下降趋势。在贮藏第6～15天内，处理组VC含量均显著高于对照组（P＜0.05）。由此可知，低温等离子体处理可以延缓鲜黄花菜采后VC含量的下降，这可能是低温等离子体处理过程中释放的活性粒子抑制了VC的氧化[28]，使其保持较高的营养价值。

图9 低温等离子体处理对采后黄花菜VC含量的影响Fig. 9 Effect of cold plasma treatment on VC content of postharvest daylily

2.8 低温等离子体处理对采后黄花菜a*值的影响

色泽是决定黄花菜感官品质的重要指标。鲜黄花菜含有大量叶绿素，所以其色泽偏绿。由图10可知，随着贮藏时间的延长，鲜黄花菜的a*值总体呈逐渐上升的趋势，是因为叶绿素在贮藏期间不断降解[5]。贮藏前期，处理组与对照组a*值差异不显著（P＞0.05），贮藏第9～15天，对照组a*值显著高于处理组（P＜0.05）。由此可知，低温等离子体处理可以延缓贮藏后期鲜黄花菜的褐变，使鲜黄花菜保持较好的感官品质。

图10 低温等离子体处理对采后黄花菜a*值的影响Fig. 10 Effect of cold plasma treatment on a* value of postharvest daylily

2.9 低温等离子体处理对采后黄花菜中水分迁移规律的影响

横向弛豫时间（T2）的长短可表征水分的流动性，弛豫时间短，说明水分流动性差，横向弛豫时间越长，说明水分流动性越强，因此可通过测定横向弛豫时间T2的变化来研究黄花菜内部水分的迁移变化情况。从图11可以看出，对照组和处理组在不同贮藏时间的低场核磁共振图中均出现3个峰，从左至右为结合水（1～10 ms）、不易流动水（10～100 ms）和自由水（100～1 000 ms）[29]。自由水是黄花菜的主要水分状态，所占峰面积比例最大，为90%左右。

图11 采后黄花菜贮藏过程中的水分迁移规律Fig. 11 Effect of cold plasma treatmentwater migration in postharvest daylily during storage

图11中两组核磁信号峰均出现了横向位移，说明各个状态的水分子之间出现了相互转化。如图11B所示，在对照组的T2曲线中，贮藏15 d时出现了峰肩相融合的趋势。一般情况下，当生物体细胞的生物膜处于完整状态并具备选择透过性时，各个细胞器之间或者细胞膜内外，不同状态的水分子之间不会相互干扰，进而影响核磁信号[30]。但当受到外界不良条件的影响，不同区域的水分子（或溶质）可能会相互渗透产生干扰。因此，图11B中对照组T2曲线不易流动水和自由水出现峰肩融合现象的原因可能是贮藏末期黄花菜细胞生物膜系统受到攻击，如微生物、ROS等，从而使细胞膜的透过性增加，使不同区域内的水分互相干扰造成核磁信号峰出现变化。相比之下，处理组黄花菜的核磁信号峰之间未出现位移相融的现象，各个水分状态更接近于新鲜黄花菜。

通过峰面积归一化法对不同状态的水分含量（以峰面积表征）进行如表1所示处理，可以反映黄花菜在贮藏初期（第0天）、贮藏中期（第6天）、贮藏末期（第15天）黄花菜中结合水、不易流动水和自由水的迁移情况。如表1所示，黄花菜在贮藏期间，自由水含量逐渐减少，而结合水含量则基本不变，不易流动水含量先上升后下降；处理组不易流动水含量显著低于对照组（P＜0.05），自由水含量也显著高于对照组（P＜0.05），表现出较强的持水性容量。结合图11可以看出，低温等离子体处理可以较好地维持黄花菜的水分，保持其新鲜度，这可能是因为低温等离子体处理的杀菌作用与提高抗氧化酶活性的协同作用，保持了黄花菜细胞膜的完整性，维持了正常的膜透过性功能，使各个水分状态更稳定，从而减缓黄花菜采后衰老变质。

表1 低温等离子体处理对黄花菜水分状态的影响Table 1 Effect of cold plasma treatment on moisture state in daylily

3 讨 论

ROS的积累会导致植物细胞膜的氧化损伤和脂质过氧化，ROS引起的干扰可通过ROS清除酶系统和非酶清除系统最小化。ROS清除酶系统主要包括SOD、CAT和POD，其可直接清除细胞内产生的或外界进入细胞中的多余ROS，SOD催化超氧阴离子使其降解为H2O2，CAT和POD将H2O2还原为H2O和O2。低温等离子体处理过程中产生的ROS可能会诱导贮藏前期的SOD活力提高，显著提高贮藏期间CAT和POD活力（P＜0.05）。这与Puac等[31]研究发现低温等离子体处理会导致胡萝卜体内SOD和POD活力增加的结果是一致的。

低温等离子体处理可以减缓H2O2和MDA的积累，有效缓解采后黄花菜细胞膜相对电导率的上升，维持正常的细胞膜选择透过性。可能是因为ROS作为信号转导分子，通过诱导CAT和POD活力来调节植物细胞内ROS浓度。为了应对ROS水平的升高，黄花菜组织中的抗氧化机制被触发，CAT和POD活力增加。酶活力的增加说明细胞内存在较多的ROS，表明黄花菜细胞处于氧化应激状态。诱导CAT和POD活力可能是抑制氧化损伤、延缓采后黄花菜花蕾衰老的因素之一。

可溶性蛋白是重要的营养物质，其含量增加或积累能提高细胞的保水能力，对植物细胞生物膜起保护作用。低温等离子体处理可延缓鲜黄花菜可溶性蛋白含量的降低，从而提高黄花菜细胞的保水性，对细胞膜起到保护作用，使黄花菜保持较好的营养价值。TSS和VC也是鲜黄花菜中重要的营养物质，低温等离子体处理对鲜黄花菜中TSS质量分数无显著影响，低温等离子体处理有效延缓了VC含量的下降。色泽是评价鲜食黄花菜感官品质的重要指标，低温等离子体处理延缓了鲜黄花菜a*值的上升，抑制了鲜黄花菜的褐变。水分分布测定结果表明，贮藏末期，处理组黄花菜不易流动水含量显著低于对照组（P＜0.05），自由水含量显著高于对照组（P＜0.05），使黄花菜表现出较强的持水性和新鲜度，综合以上可知，低温等离子体处理可减缓可溶性蛋白的水解、诱导抗氧化酶的活性，从而抑制ROS积累以及膜脂过氧化作用，延缓细胞膜透过性的增加，减少黄花菜的水分流失，保持黄花菜水分活度，防止鲜黄花菜采后的衰老变质，延长其货架期。低温等离子体技术在农产品的采后贮藏和加工中具有广阔的应用前景[32]。

综上所述，低温等离子体在110 kV、110 Hz下处理鲜黄花菜150 s，可以诱导鲜黄花菜贮藏前期的SOD活力，显著提高CAT和POD活力（P＜0.05），抑制H2O2积累，显著抑制MDA积累（P＜0.05），显著延缓细胞膜透过性的增加（P＜0.05）和黄花菜可溶性蛋白的水解，维持了黄花菜TSS质量分数，显著延缓VC含量下降和贮藏后期黄花菜a*值的上升，延缓黄花菜的褐变，从而有效减缓黄花菜采后代谢活动，使其保持较好的品质，延长其货架期。