牦牛乳硬质干酪成熟过程中生物胺与细菌群落结构分析

宋雪梅，宋国顺，梁 琪,*，张 炎，张忠明

（1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省功能乳品工程实验室，甘肃 兰州 730070）

牦牛乳蛋白质量分数为6.53%，脂肪质量分数为5.64%，平均比荷斯坦牛乳高出1 倍以上，干物质质量分数为18.38%[1]，很适宜制作干酪。牦牛乳硬质干酪出品率较高、成熟期长、风味浓郁、营养价值高。然而干酪是富含蛋白质的发酵食品，其成熟过程中伴随着酪蛋白降解而产生的游离氨基酸在干酪中存在的微生物作用下易产生生物胺。生物胺是世界范围内公认的对人体健康有影响的物质，在不同国家均出现过因食用不同干酪（如Gouda、Swiss、Cheddar、Gruyere、Cheshire）而引起生物胺中毒的报道[2-3]。

不同干酪中各生物胺含量变化范围较大[4]。干酪中生物胺种类和含量因其制作原料乳种类、工艺、成熟时间、干酪中微生物等而存在较大差异[5]。目前，生物胺引起人体中毒的限量因个体而异，很难建立统一的衡量标准[6]，除了对鱼中组胺含量有规定外，对乳及其制品没有强制规定生物胺最高限量。

生物胺是一定环境条件下，微生物氨基酸脱羧酶作用于游离氨基酸所形成。干酪中具有氨基酸脱羧酶活性的微生物对生物胺形成起着重要作用，这些微生物源自制作干酪的发酵剂或者生产过程中的污染菌[7]。乳酸菌是干酪中组胺和酪胺的主要生产者[4]。干酪中非发酵剂产生的生物胺含量高于乳酸乳球菌乳酸亚种和乳酸乳球菌乳脂亚种产生的[8]。Ladero等[9]运用荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）法对乳制品中产胺菌株定量检测时，发现粪肠球菌、短乳杆菌、弯曲乳杆菌和乳酸乳杆菌与腐胺积累相关。Shalaby等[10]发现乳酸链球菌和瑞士乳杆菌脱羧酶作用于组氨酸产生组胺。因此，通过分析干酪中微生物群落结构，有助于了解生物胺形成机理。

目前，对牦牛乳硬质干酪成熟过程中蛋白质降解及品质研究较多[11-12]，但是关于干酪成熟过程中生物胺的动态变化研究鲜见报道。因此，本实验以此为切入点，研究牦牛乳硬质干酪成熟过程中生物胺的动态变化规律，同时解析干酪的细菌群落结构，为评价牦牛乳硬质干酪质量安全和探究生物胺形成的微生物机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牦牛乳采自天祝县抓喜秀龙乡；凝乳酶 北京多爱特生物科技有限公司；嗜热发酵剂 丹尼斯克（中国）有限公司；组胺二盐酸盐、2-苯乙胺盐酸盐、酪胺盐酸盐、腐胺二盐酸盐、尸胺二盐酸盐、丹磺酰氯、L-脯氨酸、1,7-二氨基庚烷等均为分析纯 美国Sigma公司；乙腈（色谱纯）、亮氨酸、水合茚三酮、氯化镉、乙醚、碳酸氢钠（分析纯）等均为国产试剂；E.Z.N.A™ Mag-Bind Soil DNA Kit试剂盒 美国OMEGA公司；Qubit3.0 DNA检测试剂盒 美国Life公司。

1.2 仪器与设备

干酪槽为甘肃省功能乳品工程实验室自制；TGL-20M高速台式冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；PHS-3C精密pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；HWS26-电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司；真空包装机 温州市大江真空包装机械有限公司；2998 PDA四元梯度超快速液相色谱仪 美国Waters公司；WD-12氮吹仪 杭州奥盛仪器有限公司；Pico-21台式离心机 美国Thermo Fisher公司；DYY-6C电泳仪电源、DYCZ-21电泳槽 北京市六一仪器厂；FR-1000凝胶成像系统 上海复日科技有限公司；ETC 811PCR仪 北京东胜创新生物科技有限公司；Q32866Qubit®3.0荧光计 美国Invitrogen公司。

1.3 方法

1.3.1 干酪制作和取样

参考刘兴龙等[13]的方法制作新鲜牦牛乳硬质干酪，真空包装后，在4 ℃下成熟1～6个月。按照干酪成熟时间依次对其编号为SR1、SR2、SR3、SR4、SR5和SR6。将不同成熟期的干酪贮藏在－80 ℃，用于后续实验。

1.3.2 干酪pH值测定

参考Jin等[14]的方法测定pH值。称取干酪5 g，加入10 mL蒸馏水混合、匀浆后用pH计测定pH值。

1.3.3 干酪中游离氨基酸含量测定

参考Folkertsma等[15]的方法并作适当修改后测定干酪中游离氨基酸含量。称取一定量切碎的干酪，按照料液比1∶9加入蒸馏水，研钵研碎，40 ℃下放置1 h，于3 000 r/min离心30 min，再用快速滤纸过滤。取过滤液30 μL，用蒸馏水稀释到1 mL，加入2 mL镉-茚三酮溶液，84 ℃反应5 min。冷却后，于507 nm波长处测定吸光度。以亮氨酸为标准品制作标准曲线，通过标准曲线方程计算干酪中游离氨基酸含量。

1.3.4 干酪中生物胺含量测定

1.3.4.1 生物胺提取和衍生

参考Innocente等[16]的方法，称取5 g研磨均匀的干酪于试管中，加入0.1 mol/L盐酸10 mL和1 mg/mL 1,7-二氨基庚烷100 μL，均质2 min后，干酪浆液在12 000 r/min、4 ℃下离心20 min。收集上清液，用同样方法浸提残余物，将浸提液混合倒入容量瓶，用0.1 mol/L盐酸溶液定容至25 mL。

吸取1 mL溶液，加入0.5 mL饱和碳酸氢钠和1 mL（50 mg/mL）丹磺酰氯溶液于能够密封的试管中，漩涡振荡30 s后，40 ℃反应60 min。之后，加入200 μL的L-脯氨酸（100 mg/mL），漩涡振荡1 min，在室温黑暗处反应15 min。然后用1 mL乙醚萃取，4 ℃下离心3 min（3 000 r/min），吸取上层有机溶液，重复离心1 次，两次离心所得有机溶液层混合并用氮气吹干，将残留物溶解于1 mL乙腈中，经0.22 μm膜过滤后进行测定。吸取1 mL不同质量浓度的混合标准品（组胺、2-苯乙胺、酪胺、腐胺、尸胺），加入相同的1,7-二氨基庚烷内标，按照上述方法进行衍生，并绘制标准曲线。

1.3.4.2 色谱条件

参考Moret等[17]的方法并适当调整后利用高效液相色谱仪测定生物胺含量。色谱柱：Symmetry C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温：30 ℃；流速：1 mL/min；紫外检测波长：254 nm；进样量：10 μL；流动相A为水，流动相B为乙腈；梯度洗脱条件：0 min，65% B；1 min，65% B；10 min，80% B；14 min，80% B；21 min，100% B；30 min，100% B。

1.3.5 DNA提取、PCR扩增和高通量测定

利用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit提取试剂盒提取样品中总DNA，琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，Qubit定量检测DNA样本浓度。扩增16S rRNA基因V3～V4高变异区。通用引物分别为341F（5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’）和805R（5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’）。PCR扩增两轮，第一轮PCR扩增体系（30 μL）：2×Hieff®Robust PCR Master Mix 15 μL、341F和805R各1 μL、10～20 ng模板DNA、9～12 μL ddH2O。扩增条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，循环5 次；之后，94 ℃变性20 s；55 ℃退火20 s；72 ℃延伸30 s，循环20 次；最后72 ℃延伸5 min；第二轮扩增引入Illumina桥式PCR兼容引物，其体系除模板DNA为20～30 ng之外，其余与第一轮相同。扩增条件：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性20 s；55 ℃退火20 s；72 ℃延伸30 s，循环5 次；之后72 ℃延伸5 min。扩增所得PCR产物纯化回收后，构建文库，最后进行高通量测序和分析（由生工生物工程（上海）股份有限公司协助完成）。

1.3.6 高通量测序数据处理

使用Cutadapt软件去除引物接头序列，再根据PE reads之间的overlap关系，将成对的reads拼接成一条序列，然后按照barcode标签序列识别并区分样品得到各样本数据，最后使用PRINSEQ切除reads尾部质量值20以下的碱基，最终过滤掉低复杂度序列，得到各样本有效数据。

1.3.7 OTU聚类和物种注释

使用Usearch软件，按照97%相似性对非重复序列（不含单序列）进行操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）聚类，聚类过程中去除嵌合体，得到OTU代表序列，然后，使用RDP classifier比对RDP数据库，对每个OTU对应的物种进行分类注释，最终分别在门、纲、目、科、属等分类水平上统计各样本的群落组成。

1.4 数据处理与分析

每个处理重复3 次，理化数据结果用平均值±标准偏差表示，利用SPSS 19.0软件对数据进行方差分析和Pearson相关性分析，利用Excel 2007软件进行作图。使用Mothur软件进行Alpha多样性分析，利用R软件中的vegan package进行主坐标分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）和作图。

2 结果与分析

2.1 牦牛乳硬质干酪成熟过程中pH值和游离氨基酸含量的变化

pH 4.0～5.5对某些氨基酸脱羧酶活性具有重要影响。从表1可知，牦牛乳硬质干酪在1～6个月成熟过程中pH值变化趋势平缓，pH值均在5.2～5.5，这为干酪中生物胺的形成提供了有利环境。游离氨基酸是制约生物胺形成的重要因素，如组氨酸脱羧酶和鸟氨酸脱羧酶的产生紧密依赖于游离氨基酸含量，且受到微生物生长阶段的调控[18]。如表1所示，在1～6个月成熟过程中，牦牛乳硬质干酪中游离氨基酸含量呈现增加趋势，且成熟6个月干酪中游离氨基酸含量比成熟1个月干酪显著高出75.32%（P＜0.05）。

表1 牦牛乳硬质干酪成熟过程中pH值和游离氨基酸含量的变化Table 1 Changes in pH and total free amino acid contents in hard cheese made from yak’s milk during ripening

2.2 牦牛乳硬质干酪成熟过程中生物胺含量的变化

预实验中利用高效液相色谱分别确定了组胺、2-苯乙胺、酪胺、腐胺、尸胺、色胺、精胺和亚精胺等出峰时间。在测定牦牛乳硬质干酪中生物胺时，未检测出色胺、精胺和亚精胺，因此，后续以2-苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺和酪胺这5 种生物胺为标准品，以不同质量浓度标准品与内标峰面积和质量浓度之比分别作为因变量与自变量，绘制标准曲线并得到标准曲线方程，分别为y=0.085 5x－0.014 4（R2=0.977 3）、y=0.158 1x－0.001 9（R2=0.999 4）、y=0.142x－0.000 5（R2=0.999 7）、y=0.121 4x+0.019 6（R2=0.997 7）和y=0.111 6x+0.002 1（R2=0.999 0）。通过标准曲线方程，计算出干酪样品中各生物胺含量。不同成熟期牦牛乳硬质干酪中生物胺含量变化如图1所示。

图1 牦牛乳硬质干酪成熟过程中生物胺含量的变化Fig. 1 Changes in the contents of biogenic amines in hard cheese made from yak’s milk during ripening

从图1可知，牦牛乳硬质干酪中的生物胺主要为腐胺、2-苯乙胺、酪胺、组胺和尸胺，这与大多数干酪中生物胺种类相同[19]。干酪中生物胺含量最高阶段均出现在成熟后期5～6个月，这说明成熟期长的干酪含有较高生物胺含量，在大多数干酪品种中也存在类似现象。因此，成熟时间是导致生物胺积累的重要因素之一。

牦牛乳硬质干酪在1～6个月成熟过程中，其生物胺含量呈现增加趋势，但是不同生物胺含量增长趋势不同。2-苯乙胺和腐胺含量在前4个月成熟过程中增加缓慢，之后急剧增加，第6个月时，其含量最高。成熟6个月干酪中2-苯乙胺和腐胺含量分别是成熟4个月干酪中2-苯乙胺、腐胺含量的3.73 倍和3.06 倍，且两者间差异显著（P＜0.05）。尸胺在1～4个月成熟过程中含量呈现增加趋势，第4个月时，尸胺含量达到最高，随后小幅度降低后再升高，但是成熟6个月干酪中尸胺含量与成熟4个月干酪中差异不显著（P＞0.05）。2-苯乙胺是二胺氧化酶和组胺N-甲基转移酶的抑制剂。腐胺和尸胺含量的增多不但会影响干酪风味，还会通过抑制组胺氧化酶活性增强组胺毒性[20]。因此，需注意对牦牛乳硬质干酪中2-苯乙胺、腐胺和尸胺进行控制。

组胺和酪胺是两种毒性相对较大的生物胺。牦牛乳硬质干酪中组胺在1～5个月成熟过程中含量呈现缓慢增加趋势，成熟5个月时其含量达到最高,且与其他不同成熟阶段的干酪存在显著差异（P＜0.05）。干酪中酪胺在1～4个月成熟过程中含量呈现先上升再降低的趋势，之后，其含量呈现增加趋势，酪胺在成熟6个月干酪中含量最高，是成熟3个月干酪的1.99 倍，但是与成熟5个月干酪没有显著差异（P＞0.05）。成熟5个月干酪中组胺含量为（16.78±3.68）mg/kg，远低于美国食品药品管理规定的食品中组胺含量限量（不超过50 mg/kg）。成熟6个月干酪中酪胺含量为（62.33±6.11）mg/kg，也低于Brink等[21]建议的酪胺安全剂量（100～800 mg/kg）。

酪胺和腐胺是干酪中常见的、浓度较高的生物胺[22-23]，然而不同畜种乳制作的不同干酪中生物胺存在差异。Caciotta牛乳干酪中主要生物胺是腐胺和尸胺；Pecorino绵羊乳干酪中主要生物胺是酪胺和尸胺[24]。Lanciotti等[25]发现成熟末期绵羊乳干酪中生物胺含量为850 mg/kg。本实验发现，牦牛乳硬质干酪中腐胺为主要生物胺，在1～6个月成熟过程，平均占总生物胺含量的50.01%。不同成熟期干酪的总生物胺含量低于（448.29±9.56）mg/kg。Spanjer等[26]建议干酪中酪胺、组胺、腐胺和尸胺总含量不应超过900 mg/kg，Taylor等[27]认为生物胺总含量低于1 000 mg/kg的食品是安全的。因此，从干酪中组胺、酪胺和总生物胺含量来看，牦牛乳硬质干酪处于安全范围内。

2.3 牦牛乳硬质干酪中各生物胺、游离氨基酸含量和成熟时间之间的相关性分析

生物胺的积累依赖于对氨基酸的有效利用。由表2可知，牦牛乳硬质干酪中游离氨基酸含量和各生物胺含量、成熟时间之间存在正相关关系，其中游离氨基酸含量与腐胺含量、尸胺含量和总生物胺含量间均呈极显著正相关性（P＜0.01），与2-苯乙胺、酪胺含量呈显著正相关性（P＜0.05），这说明干酪中游离氨基酸含量对生物胺形成具有重要影响。在其他干酪研究中也得到类似结果[5]。成熟时间与游离氨基酸含量、各生物胺含量之间也具有较强正相关性，这进一步说明成熟时间的延长导致生物胺的积累。干酪中各生物胺含量之间存在正相关性，其中组胺含量和酪胺含量间呈显著正相关性（P＜0.05），2-苯乙胺含量与腐胺、尸胺、酪胺含量之间呈现极显著正相关性（P＜0.01），腐胺含量与尸胺、酪胺含量间以及尸胺含量和酪胺含量间也呈极显著正相关性（P＜0.01），这说明生物胺的形成具有一定同源性。

表2 牦牛乳硬质干酪中各生物胺、游离氨基酸含量和成熟时间之间的相关性分析Table 2 Pearson correlation coefficients between ripening time and the contents of total free amino acids and biogenic amines in hard cheese made from yak’s milk

2.4 牦牛乳硬质干酪中细菌群落Alpha多样性分析

Alpha多样性是反映一个特定区域或生态系统的多样性，主要通过Chao1、ACE等丰富度估计指数和Shannon、Simpson等多样性指数来体现。从表3可以看出，Shannon指数在牦牛乳硬质干酪1～4个月成熟过程中呈现下降趋势，在第5个月时呈现上升趋势，之后又呈下降趋势。这表明干酪的微生物多样性在成熟过程中呈现先下降后上升再下降的变化趋势。这主要由于是牦牛乳硬质干酪采用了真空包装，干酪处于厌氧状态中，随着贮藏时间的延长和干酪中基质环境变化，部分微生物的生长繁殖受到抑制。另外，所有样品Coverage指数接近1，表明使用的抽样方案已经基本覆盖了样本中所有细菌，数据可用于后续分析。

表3 牦牛乳硬质干酪中菌落的Alpha多样性指数Table 3 Alpha-diversity indexes of bacterial community in cheese samples

2.5 牦牛乳硬质干酪中细菌群落Beta多样性分析

Beta多样性是用来比较不同生态系统间群落的多样性。通过可视化的PCoA图能够观察和体现个体或群体间差异。本实验利用基于Bray-Curits的PCoA图解析不同成熟期牦牛乳硬质干酪样品的细菌群落差异。

由图2可知，第一主成分和第二主成分的贡献率分别为64.92%、28.26%。成熟1～6个月的干酪样品分布在4个区域。成熟2～4个月干酪样品在相同区域，说明细菌群落结构相似，成熟1、5、6个月干酪样品分别分布在不同区域，且与其他样品距离较远，说明其细菌群落结构有较大差异。这种差异也反映在不同成熟期干酪中生物胺的含量差异上。

图2 不同成熟期牦牛乳硬质干酪样品的主坐标分析Fig. 2 Principal co-ordinates analysis of cheese samples made from yak’s milk at different ripening periods

2.6 牦牛乳硬质干酪中细菌群落在门和属分类水平的分析

为进一步了解不同成熟期牦牛乳硬质干酪中细菌群落结构，在门和属水平对测序数据进行分类分析。从图3可知，所有测试样品包括两个门，分别为厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria），厚壁菌门相对丰度在84%以上，为优势菌门。在1～6个月干酪成熟中，厚壁菌门相对丰度呈现增加趋势，变形菌门相对丰度呈下降趋势。

图3 牦牛乳硬质干酪中细菌组成在门水平上的相对丰度Fig. 3 Relative abundance of bacterial phyla in cheese samples made from yak’s milk

由图4可知，成熟1～6个月的牦牛乳硬质干酪包含链球菌属、明串珠菌属、乳杆菌属、拉乌尔菌属、不动杆菌属、假单胞菌属、肠杆菌属7个属和无分类的肠杆菌科。不同成熟期干酪中链球菌属相对丰度均高于79.6%，其平均相对丰度为84.63%，为主要优势菌群，这与干酪制作过程中加入的发酵剂有关，其次为明串珠菌属，其平均相对丰度为6.91%，乳杆菌属平均相对丰度为3.97%，是干酪中第三优势菌群。

图4 牦牛乳硬质干酪中细菌组成在属水平上的相对丰度Fig. 4 Relative abundance of bacterial genera in cheese samples made from yak’s milk

明串珠菌属、拉乌尔菌属、不动杆菌属相对丰度在牦牛乳硬质干酪1～3个月成熟过程中呈现降低趋势，在3～6个月成熟过程中，3个属相对丰度呈现先上升后下降趋势。明串珠菌属相对丰度在第5个月时最高。干酪中肠杆菌属，除成熟1个月干酪外，4个月成熟干酪中相对丰度最高。假单胞菌属在干酪1～6个月成熟过程中，整体上呈现降低趋势。乳杆菌属在干酪1～3个月成熟过程中，呈现增加趋势，之后，呈现先降低后增加趋势，除成熟1个月干酪外，其平均相对丰度为4.61%。

一些学者在各种发酵剂的某些菌株中发现了酪氨酸和组氨酸脱羧酶[28-29]。嗜热链球菌被发现具有产组胺和酪胺能力[30]。链球菌属是牦牛乳硬质干酪中的主要优势菌群，大量链球菌属的存在对干酪中生物胺形成的影响作用不容忽视。大肠杆菌科和假单胞菌属是原料乳中的常见菌，一些菌株含有脱羧酶，能够产生组胺、尸胺和腐胺。明串珠菌属的某些菌株也具有产胺能力。乳杆菌属可能也含有脱羧酶，能够产生组胺、酪胺、腐胺和尸胺[31]。以上分析进一步说明了牦牛乳硬质干酪中生物胺之间的相关性，同时表明除拉乌尔菌属、不动杆菌属之外，其他菌属均存在产生物胺的可能性，后续将进一步深入对干酪中产胺微生物进行研究。

肠杆菌属、明串珠菌属、假单胞菌属、拉乌尔菌属、不动杆菌属一般来自动物乳房、农场、挤奶环境以及与乳直接接触的挤奶工人和容器[32]。牦牛乳采集于生活在青藏高原的牦牛，挤奶环境开放，挤奶方式为传统的手工挤奶。虽然在牦牛乳硬质干酪制作过程中使用了热处理，但是原料乳中部分微生物仍能够存活并在干酪成熟过程中进行新陈代谢[33-34]，很可能参与到干酪中生物胺的形成中[35]。Nout等[36]认为生物胺含量低于100～200 mg/kg的食品可被消费者接受，因此，为了确保牦牛乳硬质干酪优质品质，需要重视挤奶环节，提高原料乳质量。

3 结 论

牦牛乳硬质干酪中主要生物胺为腐胺、2-苯乙胺、酪胺、组胺、尸胺。干酪中各种生物胺含量在1～6个月成熟过程中呈现增加趋势。干酪中生物胺含量最高阶段均出现在成熟后期5～6个月。干酪中组胺、酪胺和总生物胺含量分别低于推荐安全剂量50、100 mg/kg和1 000 mg/kg。干酪中游离氨基酸含量与除组胺之外的各生物胺含量、总生物胺含量、成熟时间具有显著正相关性（P＜0.01，P＜0.05），各生物胺含量之间也存在正相关性。不同成熟期干酪包含链球菌属、明串珠菌属、乳杆菌属、拉乌尔菌属、不动杆菌属、假单胞菌属、肠杆菌属7个属和无分类的肠杆菌科。链球菌属为优势菌属，其平均相对丰度为84.63%；明串珠菌属次之，其平均相对丰度为6.91%，本研究为评估牦牛乳硬质干酪的质量安全性和生物胺形成机理提供了依据。