褪黑素处理对香菇采后品质及活性氧代谢的影响

贾 乐，韩延超，房祥军，陈杭君，郜海燕

（浙江省农业科学院食品科学研究所，农业农村部果品产后处理重点实验室，浙江省果蔬保鲜与加工技术研究重点实验室，中国轻工业果蔬保鲜与加工重点实验室，浙江 杭州 310021）

香菇（Lentinula edodes）是世界第二大食用菌，因其含有丰富的膳食纤维、维生素、矿物质等，具有独特的风味和口感，同时还具有降低血糖、血脂水平[1]、抗肿瘤[2]等功能。活性氧（reactive oxygen species，ROS）是植物体在进行正常生理代谢时产生的一系列性质活泼的含氧物质的总称，在整个贮藏期间，香菇会不断产生ROS，但在贮藏前期，由于一系列ROS清除酶活性较强，过多的ROS会被清除，ROS代谢平衡得以维持；贮藏后期随着香菇的衰老及外界不良环境的胁迫，这一代谢平衡被破坏，ROS代谢失衡会加速细胞膜脂过氧化进程，导致有毒代谢产物丙二醛（malondialdehyde，MDA）积累，细胞膜透性升高，进而加速采后衰老进程，缩短香菇寿命，这给生产和贮运造成很大的损失。因此，迫切需要找到安全有效的方法，最大限度地降低香菇贮藏期间ROS的积累、减少营养物质的损失，从而有效延长香菇的贮藏期。褪黑素（melatonin，MT）是一种普遍存在于动植物体内的一类小分子激素，具有多种细胞活性和生理活性，它在人类、动物和植物的生长发育中发挥重要功能。近年研究表明，MT具有调节植物生长、延缓叶片衰老、影响果实成熟和贮藏等作用[3-4]。MT作为一种安全的吲哚胺分子，不仅可以作为内源诱导分子和信号分子来缓解生物和非生物胁迫，还具有直接的抗氧化活性[5]，MT通过激活机体抗氧化系统，直接清除ROS，提高抗氧化物质的活性[6]，延长果蔬采后寿命[7]。研究表明，外源MT处理可以延缓香蕉采后成熟[8]；延缓黄瓜采后贮藏过程中抗坏血酸（ascorbic acid，AsA）和可溶性蛋白含量的下降[9]；通过增强抗氧化酶活性和抑制细胞膜脂过氧化程度，有效维持桃果实感官和营养品质，提高桃果实的耐冷性，延长桃的保质期[10-12]；MT处理还可促进草莓果实中苯酚和花色苷的积累，维持草莓采后果实品质，降低草莓采后腐烂率[13]；蛋白质组学分析表明，MT处理可以调控番茄采后的成熟和衰老，衰老相关蛋白的表达经MT处理后发生下调表达，细胞凋亡抑制相关蛋白经MT处理后发生上调表达[14]；在木薯上的研究也证明了MT处理通过提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）活性，降低H2O2积累，从而延迟木薯根采后生理变质[15]。这些研究表明，MT作为一种新型、天然、安全的保鲜剂，能够有效提高果蔬的抗氧化能力，维持果蔬的采后品质，具有较好的应用前景。然而，将MT应用于香菇的保鲜研究鲜有报道。本实验通过研究外源MT喷淋处理对香菇贮藏过程中品质变化及活性氧代谢的影响，旨在明确MT对香菇采后保鲜的作用及相关生理机制，为鲜香菇采后贮藏产业应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜香菇（品种‘901’）购于浙江武义创新食用菌有限公司，挑选大小均一、无开伞、没有病害和机械损伤的完整菌菇。

MT 上海源叶生物有限公司；三氯乙酸、福林-酚、甲醛，硫代巴比妥酸（分析纯）、邻菲罗琳、AsA、盐酸羟胺、三氯化铁、H2O2、氢氧化钠 上海凌峰化学试剂有限公司；羟自由基测定试剂盒、羰基化蛋白试剂盒 南京建成生物有限公司。

1.2 仪器与设备

TA.XT plus型物性测定质构仪 英国SMS公司；Hitachi H7650型透射电子显微镜 日本日立公司；UV-9000紫外-可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；Spectra-MAX-M2多功能酶标仪 瑞士TECAN公司；Fresco17型高速冷冻离心机 美国赛默飞世尔公司；DDS-307A型电导率仪 上海仪电科学仪器股份有限公司；CR-400手持色差仪 日本柯尼卡美能达公司。

1.3 方法

1.3.1 香菇样品处理

清除香菇基部栽培基质，随机分成4 组，每组处理量1.0 kg，3个重复，分别使用清水（对照组）、0.25、0.50、0.75 mmol/L的MT溶液均匀喷洒于香菇表面，每1 kg香菇固定喷洒50 mL MT溶液，置于通风处使香菇表面水分完全蒸发，用聚乙烯包装袋进行分装。将分装好的香菇放置于（4±1）℃恒温箱中贮藏，取样间隔为7 d，每次将取得的样品用液氮速冻后放入－50 ℃冰箱，取样完成后，进行各项指标的测定，结果取其平均值。

1.3.2 香菇相关指标的测定

1.3.2.1 开伞度和色泽的测定

用游标卡尺对香菇的开伞度进行测定。将香菇卷边内缘的距离（L0）与外缘距离（L1）的比例作为开伞度值，最大开伞度记为1，每组处理随机测定10个香菇，结果取其平均值[16]。色泽测定参考Ganjloo等[17]的方法并加以修改，用手持色差计测定。每组随机选取10个香菇对香菇菌盖进行测定，记录色差仪上的L*、a*、b*值，最终结果取其平均值。按式（1）计算褐变指数。

1.3.2.2 硬度与呼吸强度的测定

参考文献[18]的方法并略作修改，选取P/6型不锈钢探头，直径为56 mm，下压距离5.0 mm，测前速率2.0 mm/s，测定速率1.0 mm/s，测后速率2.0 mm/s，以最大破裂的力作为硬度，每次随机选取10个香菇进行测定，最终结果取其平均值，单位为kg/cm2。呼吸强度采用碱液吸收法[19]进行测定，单位为mg/（kg·h）。

1.3.2.3 AsA、总酚含量及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除能力的测定

AsA含量的测定参考文献[20]并稍作修改。称取1.0 g香菇研磨样品，加入体积分数5%的三氯乙酸溶液5.0 mL，振荡混匀，10 000 r/min离心20 min取上清液。吸取0.5 mL上清液于试管中，依次加入1.5 mL三氯乙酸、1.0 mL无水乙醇、0.5 mL 0.5%磷酸-乙醇溶液、1.0 mL 0.5%邻菲罗啉-乙醇溶液、0.5 mL 0.03%三氯化铁-乙醇溶液，30℃水浴60 min，以加入蒸馏水代替邻菲罗啉-乙醇溶液的试管为参照，534 nm波长处测定吸光度，根据标准曲线方程计算AsA含量，结果以mg/100 g表示。

总酚含量的测定采用福林-酚法[21]。称取0.25 g香菇研磨样品于离心管中，加入1.25 mL乙醇溶液（体积分数60%），浸提2 h后于10 000r/min离心20 min，取0.2 mL上清液进行测定，以没食子酸为标准品绘制标准曲线，计算样品中的总酚含量，单位为mg/g。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力的测定：称取0.25 g香菇研磨样品于离心管中，加入1.25 mL无水乙醇，1 200 r/min离心30 min，取0.1 mL上清液（样品组），加入2.9 mL的DPPH-乙醇溶液（0.1 mmol/L），以等量蒸馏水作为空白组，混匀后避光反应30 min，以加入2.9 mL无水乙醇为对照组，分别测定各组在517 nm处的吸光度，按式（2）计算DPPH自由基清除能力。

式中：A0表示空白组在517 nm处的吸光度；A1表示样品组在517 nm处的吸光度；A2表示对照组在517 nm处的吸光度。

1.3.2.4 超氧阴离子自由基产生速率与H2O2含量的测定

超氧阴离子自由基产生速率的测定参考Li Xiaoan等[22]的方法，以KNO2为标准品绘制标准曲线，计算样品中超氧阴离子产生速率，单位为μmol/（min·g）。H2O2含量的测定参考文献[19]的方法，单位为μmol/g。

1.3.2.5 细胞膜透性及丙二醛含量的测定

细胞膜透性测定参考Luo Yaguang等[23]的方法并稍作修改，分别从香菇的中心和四周随机切取约1 g的香菇片（厚度1 mm），放入50 mL离心管中，加水定容至50 mL。室温下静置10 min后用电导率仪测定电导率，记为R1/（μS/cm），随后沸水浴5 min，自然冷却至冷却至室温后再次测其电导率，记为R2/（μS/cm），根据公式（3）计算相对电导率（relative electric conductivity，REC），用REC表示细胞膜透性。

MDA含量测定采用硫代巴比妥酸比色法，具体方法参考文献[24]并略作修改，取0.25 g香菇研磨样加入1.5 mL 100 g/L的三氯乙酸溶液，混匀后在4 ℃下10 000 r/mim离心20 min后得上清液，取0.75 mL上清液加入等体积0.67%（质量分数）硫代巴比妥酸溶液，混匀后沸水浴20 min，取出冷却后离心，分别用酶标仪测定其在450、532、600 nm处的吸光度，根据式（4）计算待测液中MDA浓度（c），根据式（5）计算香菇中MDA含量。

1.3.2.6 羟自由基生成能力及羰基化蛋白质量浓度的测定

取0.2 g香菇研磨样于离心管中，加入1.8 mL生理盐水，4 000 r/min、4 ℃下离心10 min，取上清液采用羟自由基测试盒测定羟自由基生成能力，单位为U/mL。羰基化蛋白质量浓度取上清液后采用羰基化蛋白试剂盒测定，单位为ng/mL。

1.3.2.7 线粒体超微结构观察

参照赵天鹏[25]的方法略作修改，用戊二醛固定液固定香菇（新鲜香菇、贮藏28 d MT处理组、贮藏28 d对照组）组织，然后进行漂洗，完成后进行梯度脱水和渗透，之后用包埋剂处理，并在烘箱中保温聚合48 h，用超薄切片机对香菇组织进行切片（70 nm厚），然后用捞样环将切片圈起来，用滤纸蘸取氯仿在捞样环上方划过，进行熏蒸，熏蒸后置于铜网上，用2%的醋酸双氧铀染色10～15 min，漂洗后再用含有氢氧化钠的柠檬酸铅染色10～15 min，选择30 000×放大倍数，观察香菇细胞及线粒体的完整性。

1.4 数据处理与分析

采用Excel 2010软件对数据进行整理，利用SPSS软件，采用Duncan法对数据进行显著性分析，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。采用GraphPad Prism 8软件进行数据处理和绘图。

2 结果与分析

2.1 MT处理对香菇采后褐变度与亮度的影响

香菇的褐变程度可用褐变指数表示，L*值代表香菇的亮度。如图1A所示，在整个贮藏期间，香菇褐变指数不断上升，对照组褐变指数始终高于MT处理组。香菇L*值呈下降趋势，即香菇亮度不断下降，如图1B所示，与其他处理组相比，0.50 mmol/L MT处理组L*值下降最为缓慢，在贮藏至第42天时，0.25、0.50、0.75 mmol/L MT处理组的L*值分别是对照组1.61、1.87、1.60 倍，说明MT处理可以抑制香菇褐变，其中0.50 mmol/L MT处理可维持香菇较高的亮度。

图1 MT处理对香菇褐变度（A）与L*（B）的影响Fig. 1 Effect of melatonin treatment on the browning degree (A) and L* value (B) of shiitake mushrooms

2.2 MT处理对香菇采后硬度与开伞度的影响

硬度是反映香菇品质较为直观的指标之一，随着贮藏时间的延长，各组香菇硬度均呈下降趋势，由图2A可知，在贮藏前期，不同浓度MT处理后的香菇硬度与对照组无显著性差异，在贮藏中后期各不同浓度MT处理后的香菇硬度的维持情况比对照组要好。在贮藏至21 d时，对照组的硬度（3.04 kg/cm2）显著低于0.50 mmol/L MT处理组（6.44 kg/cm2）。香菇的开伞度可以反映香菇的衰老程度，由图2B可知，香菇开伞度在贮藏期间不断增加，在贮藏前期，对照组与各不同浓度MT处理后的香菇无显著性差异，贮藏21 d后，处理组与对照组之间的差异逐渐显现，其中以0.50 mmol/L MT处理组开伞度最低。因此，通过一定浓度的MT处理可以有效保持香菇的硬度并抑制其开伞。

图2 MT处理对香菇硬度（A）及开伞度（B）的影响Fig. 2 Effect of melatonin treatment on the hardness (A) and cap opening (B) of shiitake mushrooms

由以上实验结果可知，在香菇的采后贮藏过程中，MT处理能够有效维持香菇表观品质劣变，其中以0.50 mmol/L MT处理效果最为显著，因此，以下对实验均以0.5 mmol/L MT处理组与对照组进行比较。

2.3 MT处理对香菇采后呼吸强度的影响

香菇采后呼吸强度是反映其生命活动强弱的重要指标，与生物体内其他生命活动也密切相关。由图3可知，在整个贮藏期间，香菇呼吸强度在贮藏过程中各组之间整体变化趋势一致，前期呈先下降后上升的趋势，出现呼吸高峰后再下降，在贮藏结束时，呼吸强度又上升，前期呼吸强度下降可能由于香菇贮藏温度的改变（从常温到低温）导致，贮藏末期呼吸速强度高可能是由于子实体受外界微生物侵染，腐烂后释放出CO2，使测定的呼吸速率上升。其中0.50 mmol/L MT处理组始终保持在最低水平。贮藏42 d时，处理组香菇的呼吸强度与对照组相比降低了44%。

2.4 MT处理对香菇H2O2含量、超氧阴离子生成速率与羟自由基生成能力的影响

H2O2与超氧阴离子都是细胞内ROS的存在形式，过度积累会对细胞造成不可逆的损伤，羟自由基是细胞内ROS的重要组成部分，羟自由基生成能力在一定程度上反映了细胞内ROS代谢强弱，在贮藏期间，香菇细胞内的H2O2含量与超氧阴离子产生速率及羟自由基生成能力均呈上升趋势。如图4A所示，整个贮藏期间对照组的H2O2含量始终高于MT处理组，贮藏后期，对照组H2O2含量上升速率明显高于0.50 mmol/L MT处理组，贮藏结束时，对照组H2O2含量为0.26 μmol/g，是MT处理组的1.44 倍。由图4B可知，对照组超氧阴离子生成速率持续上升，直至贮藏结束达到最高值2.37 mol/（min·g），而MT处理组的超氧阴离子生成速率只在贮藏前期有较明显的升高，之后便一直保持在较低的水平，在贮藏前期（0～14 d），MT处理组与对照组之间差异不显著（P＞0.05），贮藏14 d之后，MT处理组与对照组之间差异明显，在贮藏结束时，处理组香菇的超氧阴离子的生成速率与对照组相比分别降低了39.1%。由图4C可知，在整个贮藏期间，羟自由基生成能力持续上升，贮藏末期，对照组羟自由基生成能力达到7.16 U/mL，比MT处理组高了32%，且两者差异极显著（P＜0.01）。以上说明说明MT处理组可有效缓解香菇体内H2O2含量的积累，抑制香菇细胞的超氧阴离子生成速率和羟自由基生成能力，从而减缓ROS对细胞的伤害。

图4 MT处理对香菇H2O2（A）、超氧阴离子生成速率（B）及羟自由基生成能力（C）的影响Fig. 4 Effect of melatonin treatment on H2O2 content (A),superoxide anion generation rate (B) and hydroxyl radical generation capacity (C) in mushrooms

2.5 褪黑素处理对香菇细胞膜透性、MDA含量及羰基化蛋白质量浓度的影响

细胞膜的完整性可以反映细胞膜的受损程度，而细胞膜完整性可以通过测定组织的水浸提液的电导率来反映[26]。由图5A可知，在贮藏前期，香菇细胞的REC变化趋势较为平缓，0.50 mmol/L MT处理组与对照组之间没有显著差异，贮藏28 d后，对照组香菇REC急剧上升，在贮藏35 d达到峰值70.3%，而贮藏35 d的0.50 mmol/L MT处理组REC仅为33.7%，上升缓慢，在贮藏末期时，MT处理组REC极显著低于对照组。说明经MT处理的香菇在贮藏期间细胞膜透性变化较小，可以较好地保持细胞膜完整性。MDA是细胞膜脂氧化产物，由图5B可知，在整个贮藏期间，各组MDA含量变化趋势较为一致，0.50 mmol/L MT处理组MDA含量始终显著或极显著低于对照组（P＜0.05、P＜0.01）。以上结果说明，0.50 mmol/L MT处理可有效保持香菇细胞膜的完整性，减少细胞电解质外泄，抑制膜脂过氧化，从而延长贮藏时间。羰基化蛋白是ROS介导的蛋白质氧化损伤产物，其含量可用来反映细胞的氧化损伤程度。由图5C可知，羰基化蛋白质量浓度在贮藏前期急剧上升，贮藏中后期变化趋势较为平缓，在整个贮藏期间，对照组的羰基化蛋白质量浓度始终高于MT处理组，说明MT处理可有效降低香菇细胞内蛋白氧化损伤程度。

图5 MT处理对香菇REC（A）、MDA含量（B）及羰基化蛋白质量浓度（C）的影响Fig. 5 Effect of melatonin treatment on the relative conductivity (A),MDA (B) content and carbonylated protein content (C) of shiitake mushrooms

2.6 褪黑素处理对香菇AsA与总酚含量及DPPH自由基清除能力的影响

AsA与总酚与香菇的抗氧化性密切相关[27]。由图6A可知，香菇AsA含量在贮藏期间呈现先下降后上升的趋势，贮藏前期AsA含量下降可能与子实体品质劣变相关，后期AsA含量上升可能与菇体失水有关[28]。在整个贮藏期间，对照组AsA含量始终低于MT处理组。如图6B所示，在贮藏前期，由于香菇采后的生长发育，各组香菇中总酚含量呈上升趋势，随后各组的总酚含量又开始下降，贮藏第42天时，0.50 mmol/L MT处理组总酚含量较对照组提高了1.37 倍。DPPH自由基清除能力可以较为直观地展现香菇的抗氧化能力，自由基清除率越高，表明果实的抗氧化能力越强。由图6C可知，整个贮藏期间，处理组与对照组的DPPH自由基清除能力均呈现下降趋势，MT处理组下降趋势较为缓慢，在贮藏第35天时，MT处理组DPPH自由基清除能力是对照组的1.17 倍，且直到贮藏结束，MT处理组DPPH自由基清除能力始终高于对照组。

图6 MT处理对香菇AsA含量（A）和总酚含量（B）及DPPH自由基清除力能力（C）的影响Fig. 6 Effect of melatonin treatment on the contents of ascorbic acid (A)and total phenols (B) and DPPH radical scavenging capacity (C) in shiitake mushrooms

2.7 细胞壁及线粒体超微结构观察结果

线粒体呼吸链上的电子泄漏是机体内ROS的主要来源[29]，因此线粒体形态与香菇ROS代谢之间关系密切。由图7A可知，新鲜香菇线粒体形态饱满，呈椭圆形，结构清晰，基质丰富，双层膜结构完整，无破损现象，细胞壁边界清晰。贮藏28 d后，对照组线粒体降解，线粒体膜损伤，内部基质降解成絮状物质，细胞壁完全降解（图7B）；而MT处理组细胞壁虽发生降解，但其结构仍能观察到，线粒体结构完整，内容物无渗出现象（图7C)，说明MT处理可有效维持香菇线粒体结构的完整，延缓细胞壁的降解。

图7 MT处理对贮藏香菇细胞壁及线粒体形态的影响Fig. 7 Effect of melatonin treatment on cell wall and mitochondrial morphology of shiitake mushrooms

3 讨 论

香菇采后极易失水、腐烂、变质，严重影响其商品价值和食用品质。MT作为一种无毒无害的新型保鲜剂，现已成为果蔬采后保鲜领域的研究热点。活性氧主要在光合作用与呼吸作用的电子传递链传递过程中产生，因香菇中没有叶绿体，故香菇中ROS主要在线粒体中产生。目前已知线粒体呼吸链上的电子泄露是机体内ROS的主要来源[30]。采后ROS在果蔬体内的主要存在形式为羟自由基、超氧阴离子、H2O2等[31]。旺盛的呼吸作用会消耗大量的营养物质，释放呼吸热与水分，造成高温高湿的环境，加速采后香菇品质的劣变。本研究发现，MT处理可以有效降低贮藏期间香菇的呼吸强度，延缓香菇子实体硬度和色泽的下降，降低香菇的开伞度，维持香菇的表观品质，0.50 mmol/L MT处理组效果最为显著；然而，辛丹丹等[32]研究表明，以0.10 mmol/L MT处理，能显著延缓黄瓜品质和抗氧化能力的下降，不同种类果蔬的MT有效处理浓度和方式存在不同，这可能是作用对象与作用方式（浸渍与喷淋）不同。MT处理还能减少细胞内H2O2含量的积累，降低超氧阴离子自由基产生速率及羟自由基生成能力，通过降低活性氧代谢产物的生成速率减轻活性氧对细胞造成的伤害。黄鸿晖等[33]研究发现，MT处理可有效抑制草莓的H2O2积累及降低超氧阴离子生成速率，与本研究结果一致。ROS的积累可促进采后果实的衰老，加速膜脂过氧化进程与蛋白质氧化程度，导致脱氧核糖核酸链的断裂，影响正常的碱基修饰及基因表达调控[34]。总酚与AsA在ROS非酶促清除系统中发挥着重要的作用[35]，在整个贮藏期间，MT处理组香菇体内的总酚含量和AsA含量始终高于对照组，在对MT处理大枣[36]和芒果[37]中也得到相同的实验结果，这可能与MT是一种强抗氧化剂和自由基清除剂有关，可以直接对ROS进行清除[38]。自由基清除能力能直观反映果蔬的抗氧化能力[39]，MT处理组DPPH自由基清除能力始终显著高于对照组，MT处理组通过增强自由基的清除能力，减少了细胞内ROS的积累，延缓了膜脂过氧化进程，减少了细胞内有毒物质MDA的产生，维持完整的膜结构，从而维持香菇采后品质。本研究还发现，MT处理可有效抑制香菇体内羰基化蛋白质量浓度的上升，延缓香菇线粒体的降解，维持正常线粒体形态。香菇体内ROS的主要产生部位是线粒体[40]。ROS的积累对线粒体蛋白质造成氧化损伤，导致线粒体各组成部分功能障碍，最终加速衰老[41]。

4 结 论

本实验结果表明，一定浓度范围的MT处理对香菇表观品质的维持具有积极作用，与0.25、0.75 mmol/L MT处理相比，0.50 mmol/L MT处理能更好地维持香菇的硬度、色泽与开伞度等表观品质，抑制呼吸强度及开伞度。进一步研究发现，0.50 mmol/L MT处理香菇可以有效降低羟自由基生成能力和超氧阴离子自由基产生速率，减少细胞内H2O2、羰基化蛋白及MDA积累，维持细胞膜的完整性，同时能够延缓其体内总酚和AsA等抗氧化物质含量的下降，提高DPPH自由基清除能力，提高机体的抗氧化能力，超微电子显微镜观察发现MT处理能够有效维持香菇细胞线粒体的完整性。综上，0.50 mmol/L MT处理可有效维持香菇贮藏品质，降低ROS代谢对细胞造成的损伤，延长香菇贮藏保鲜时间。