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黄花倒水莲总皂苷抗凝血和抗血栓作用及机制:基于网络药理学

2022-01-06刘育铖毛思宇胡倩梅

食品科学 2021年23期
关键词:抗凝血肝素靶点

刘育铖,毛思宇,李 昱,胡倩梅,邹 辉,冯 星,*

(1.湖南师范大学医学院,湖南 长沙 410013;2.湖南师范大学 小分子靶向药物研究与创制湖南省重点实验室,湖南 长沙 410013)

黄花倒水莲(Polygala fallaxHemsl,PFH)为远志科远志属黄花倒水莲的干燥根,在湖南省内资源丰富,具有补益气血、健脾利湿、活血调经等功能,可用于急性慢性肝炎、跌打损伤、腰膝酸软、病后体弱等疾病的治疗,还具有一定的抗衰老作用,为少数民族瑶族的常用药物,是南方传统的药食同源植物,民间常用其根部来炖煮肉类进行食疗[1-2]。PFH主要成分可大致分为皂苷类、山口酮类、有机酸类和脂类等[3-5],目前关于PFH的研究表明其药理作用主要有以下4个方面:1)调血脂:黄花倒水莲总皂苷(total saponin ofPolygala fallaxHemsl,PTS)降低高脂血症病人机体内甘油三酯、总胆固醇以及低密度脂蛋白的含量,提高高密度脂蛋白含量[6-7];2)抗凝:PFH水提取液可增加家兔的血浆复钙时间、部分凝血活酶时间,同时可以抑制小鼠的足跖肿胀;3)抗氧化:口山酮类成分可以明显降低小鼠肝脏中过氧化脂质含量,对小鼠血液细胞中超氧化物歧化酶的活性提升有一定作用;4)抗癌:PFH乙酸乙酯提取物可抑制肝癌细胞HepG2的增殖并促进其凋亡[8-10]。目前,关于PFH的临床应用主要为:PFH熬制成的口服液治疗原发性的高脂血症,黄花参肝舒袋、白莲汤治疗慢性乙型肝炎[11-12];而关于其抗凝血活性的相关应用鲜见报道。PFH为少数民族特色药材,其价值没有获得充分的开发与利用,且已有初步研究表明PFH水煎液具有抗凝血效果,但未作深入探讨,通过对PFH的化学成分、抗凝血作用及其机制的研究,为后续研究开发新型的抗凝血、抗血栓药物奠定基础。

网络药理学是一个结合多种学科的综合概念,英国科学家Hopkins于2007年第一次解释了其概念[13-15],这是一种对系统机制研究、药物疗效评估和药物开发设计的科学研究方法[16]。王林海等[17]运用了网络生物学的相关概念,对蛋白质、基因与药物之间互相影响关系进行了集中分析,他们发现许多与疾病相关联的蛋白和药物之间的影响关系不全是直接的,也有部分是通过间接作用来发挥其疗效。中草药多组分、多靶点及其各组分共同作用的特点使之成为了一个复杂的体系[18-20],其信息量巨大,具有复杂的成分、丰富的靶点和庞大的系统,想从混合物的系统上展开其对人体影响的研究有着诸多难点。而将网络药理学和中草药相结合的研究方法则顺应了两者之间的核心思想,探究事物的角度都是从事物之间的互相联系这一要点出发[21-22]。充分利用网络药理学的层层关系建立成分-靶点-通路-疾病模型,可对传统中草药的配伍、组方、君臣佐使规律、作用靶点的识别和药效学物质理论基础进行科学合理的解释,为复杂中草药系统的研究、临床前治疗方案的研究提供了新的思路和方法[23]。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

无特定病原体级远交群(sprague dawley,SD)大鼠,日龄56~59 d,生产许可证号:SCXK(鄂)2017-0012。

PFH药材采摘自湖南省郴州市桂东县,经由湖南师范大学医学院药学系盛习锋副教授鉴定为远志科远志属PFH的干燥根。

正常凝血质控血浆、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)试剂盒、CaCl2、凝血酶时间(thrombin time,TT)试剂盒、凝血酶原时间(prothrombin time,PT)试剂盒 德国TECO GmbH公司;NaOH 天津市大茂化学试剂厂;Tris-HCl 美国Amresco公司;低分子肝素 法国Sanofi-Aventis公司;磺达肝癸钠 英国Glaxo Smithkline公司;肝素Anti-FIIa试剂盒、肝素Anti-FXa试剂盒 法国Hyphen Bio Med公司;复方血栓通胶囊 广东众生药业股份有限公司;FeCl3溶液上海阿拉丁生化科技股份有限公司;无水乙醇、二甲苯、中性树胶、水合氯醛 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

1100分析型高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)仪 美国安捷伦公司;MC-4000血液凝固分析仪 德国Teco GmbH公司;Vortex Genie漩涡振荡器 美国Scientific Industries公司;ELx 808酶标仪 美国Bio-Tek公司;XS 105DU电子天平美国Mettler Toledo公司;100~1 000 μL移液枪 德国Eppendorf公司;500T标准型血凝杯 德国Teco GmbH公司;JB-P5包埋机 武汉俊杰电子有限公司;RM2016病理切片机 日本徕卡(上海)公司;Eclipse ci正置光学显微镜、DS-U3成像系统 日本尼康仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PTS的提取

通过热回流法提取PTS,将PFH根部粉末按照1∶30的料液比加入体积分数70%乙醇溶液,于回流提取装置(65 ℃、250 W、50 kHz)提取1 h,提取2 次,合并提取液,旋蒸后溶于去离子水中,并依次用氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取。将正丁醇馏分溶于去离子水中,通过D101大孔树脂柱,用去离子水-不同体积分数乙醇溶液梯度洗脱,得到20%、70%、95%乙醇组分以及水组分的PTS提取液。用旋转蒸发蒸仪回收乙醇后置于冷冻干燥机中挥干水分,即得PTS干燥粉末,之后进行含量测定。

1.3.2 PTS中皂苷A质量分数的测定

样品处理:精密称取PTS 5 mg,用无水甲醇溶解,并转移至10 mL的容量瓶内,定容至刻度,摇匀,并用0.45 μm微孔滤膜过滤,得到质量浓度0.5 mg/mL的样品储备液。

对照品处理:精密称取PTS中皂苷A对照品1 mg,用甲醇溶解,转移至10 mL容量瓶中,摇匀,用甲醇定容至刻度,得到质量浓度为0.1 mg/mL的对照品储备液。再从储备液中分别吸取20、50、100、150、200 μL于10 mL容量瓶中,摇匀并定容至刻度,获得PFH中皂苷A对照品溶液。

色谱条件:流动相:乙腈与0.05%磷酸(40∶60,V/V),检测波长:210 nm,进样量:10 μL,流速:1.0 mL/min,柱温40 ℃。

标准曲线的建立:分别吸取对照品溶液各10 μL进样测定。以峰面积(Y)对质量浓度(X)进行线性回归,即得标准曲线。再吸取样品溶液10 μL进样测定并计算出PTS中的皂苷A质量分数。

1.3.3 网络药理学预测PTS有效成分的作用靶点

以PFH、Polygala fallaxHemsl、黄花远志等关键词在TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php)、ChEMBL(https://www.ebi.ac.uk/chembl/)、Chemistry Database(http://www.organchem.csdb.cn)、中医药系统药理学数据库(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)等数据库以及现有文献报道中查询PFH的相关成分及其相关作用靶点,将上述成分结构式的Mol2文件上传至靶点预测工具Swiss(http://www.swisstargetprediction.ch)和DrugBank(https://www.drugbank.ca)得到每个成分所对应的一系列可能靶点以及每个靶点的Uniport编码(Uniport ID)、自由度(Degree)、相关疾病和相关通路,并保存为Excel文件。然后将上述有效成分的靶点代入String工具中,得到PTS的蛋白相互作用网络图,并对其进行京都基因与基因百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析和基因本体(gene ontology,GO)分类生物学过程分析。以FII和PTAFR为关键词,在KEGG(https://www.kegg.jp/)搜索,将检索得到的通路图重新组合,得到凝血因子II(coagulation factor II,FII)和血小板活化因子受体(platelet activating factor receptor,PTAFR)的凝血机制通路图。

1.3.4 APTT、TT、PT的测定

APTT、TT、PT测定均依据试剂盒说明书进行实验操作,该方法中以低分子肝素和黄达肝葵钠作为PTS的对照品,以Tris-HCl缓冲溶液作为空白对照。

1.3.5 FIIa、FXa活力测定

抗凝血酶存在下FIIα、辅因子X(cofactor X,FX)α活力的测定:分别按照肝素Anti-FIIa试剂盒和肝素Anti-FXa试剂盒说明书进行实验操作。

1.3.6 大鼠颈总动脉血栓模型的建立及血栓形成抑制率测定

分组:36 只SD大鼠适应性饲养一周后随机分为:A组:不进行诱导处理的空白组(等剂量羧甲基纤维素钠(sodium carboxymethyl cellulose,CMC-Na)溶液);B组:通过FeCl3诱导大鼠产生动脉血栓且不进行药物处理的模型组(等剂量CMC-Na溶液);C组:血栓通胶囊组(60 mg/kg);D组:低剂量PTS(low concentration of PTS,PTS-LD)组(30 mg/kg);E组:中剂量PTS(medium concentration of PTS,PTS-MD)(60 mg/kg)组;F组:高剂量PTS(high concentration of PTS,PTSHD)(120 mg/kg),每组6 只。各组药物分别用质量分数0.5% CMC-Na溶解至所需质量浓度。

给药方式:灌胃给药,1 mL/100 gmb,每日1 次,连续15 d。

FeCl3诱导大鼠颈总动脉血栓模型:参照文献[24-28]并加以改进,最后一次给药1 h后对大鼠实施腹腔麻醉,进行颈总动脉血栓造模,沿颈正中线切开1~2 cm,钝性分离左侧颈总动脉2.5 cm,放置无菌手术巾(3 cm×2 cm)于血管下方防止FeCl3损伤血管及其周围组织,将吸有2.2 mol/L FeCl3溶液的滤纸条(1.5 cm×1.0 cm)环绕包裹并紧贴住暴露的颈动脉段,空白组放置生理盐水滤纸条,等待15 min后取下滤纸条(从滤纸条环裹后立即开始记录时间),精确剪下形成血栓位置处的血管。取下形成血栓的血管,用滤纸轻轻擦拭,擦干后于电子天平逐个称出其质量,按下式计算其血栓形成抑制率(inhibition ratio,IR)。

称质量后立即将血管放于体积分数10%甲醛试剂中24 h进行固定,取出后用流水冲洗4 h,制作石蜡切片,进行苏木精-伊红染色,通过显微镜观察血栓结构。

1.4 数据处理与分析

采用SPSS 11.5和GraphPad Prism 6.01软件进行数据分析,所有实验均重复3 次,用平均值±标准差来表示实验数据,并用One-Way ANOVA方法对数据进行统计学分析,P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著。

缩小网店服务范围的面积,增加一定网店的数量,来进行网点的扩张。通过网点拆分方法,原来一个网点所负责的服务范围现在由多个新网点来服务,原来的网点小了,但是服务范围扩张了,配送的效率也提升了,可以有效解决网点覆盖区域不够广泛的问题,减少了人员和资源的浪费,节约了资本,提高了服务水平。并撤销布局失误和市场资源匮乏以及在市场竞争中被淘汰的网点,合并那些布局不合理,但还拥有一部分市场资源的网点,优化企业管理,提高企业运行效率和企业竞争力。

2 结果与分析

2.1 PTS中皂苷A质量分数

由图1A、B可知,峰1和峰2均为皂苷A。通过标准曲线方程(图1C)计算得出,样品中皂苷A质量浓度为8.365 7 μg/mL,即该批次PTS中皂苷A质量分数为1.673%。

图1 PTS中皂苷A的HPLC图及标准曲线Fig. 1 HPLC chromatograms of saponin A in PTS and calibration curve for determination of saponin A

2.2 PTS的有效成分-作用靶点网络

通过一系列数据库分析获得PFH的52 种已知成分,以口服生物利用率≥30%或药物相似性≥0.18、药物对小肠上皮细胞通透性≥0.4为指标筛选出20 种有效成分。通过Swiss等数据库,寻找PTS的有效成分对应靶点。其中FII和PTAFR的自由度较高,自由度越高说明中药成分与其之间的联系越紧密,预测成为有效靶点的可能性和准确性也越高,并且两者都是凝血相关通路上的主要目标靶点,所以将PTS有效成分及相关靶点Excel文件导入Cytoscape 3.4.2软件并利用该软件绘制出PTS的有效成分-作用靶点网络图(图2)。靶点自由度与图形的面积成正相关关系,即图形面积越大,靶点自由度越高,靶点预测的准确性越高。

图2 PTS有效成分-作用靶点网络图Fig. 2 C-T network diagram of PTS and targets

2.3 PTS的蛋白-蛋白相互作用网络

将20 种有效成分的靶点代入Sting工具中,得到PTS的蛋白-蛋白相互作用网络图(图3),并进行KEGG通路富集分析和GO分析富集生物学过程分析,其中FII和PTAFR参与的KEGG通路主要有补体及凝血级联反应通路、血管平滑肌收缩相关通路以及钙离子信号通路等,研究目标参与的生物学过程主要有细胞表面受体信号通路、细胞增殖的调控以及代谢过程等。

图3 PTS蛋白-蛋白相互作用网络图Fig. 3 Protein-protein interaction network diagram of PTS

2.4 PTS的抗凝血机制通路

以FII和PTAFR为关键词,在KEGG数据库中搜索,将得到的通路图重新组合,得到FII和PTAFR对应的凝血机制通路图(图4)。活化的FII可连接并切割蛋白酶活化受体(protease activated receptors,PAR)1和PAR4,活化的FII还可以直接和凝血调节蛋白结合,将蛋白C从酶原形式激活转变为活化蛋白C,在Ca2+存在下可大大加快其激活过程,说明FII可能为PTS发挥抗凝血作用联系最紧密、可能性最大的靶点。

图4 PTS抗凝血机制通路图Fig. 4 Pathway diagram for the anticoagulation mechanism of PTS

2.5 PTS存在情况下对APTT的影响

由表1可知,空白对照组APTT为(33.47±0.38)s。在4~32 μg/mL低分子肝素和8~128 μg/mL磺达肝癸钠对APTT有影响。由表2可知,在0~2 mg/mL范围内,PTS可剂量依赖性地延长质控血浆APTT。对样品(低分子肝素、黄达肝葵钠、PTS)终质量浓度与APTT进行线性拟合,并由拟合方程计算延长一倍APTT所需样品质量浓度,其结果见表3,人质控血浆APTT延长一倍所需的低分子肝素、黄达肝葵钠、PTS质量浓度分别为9.90、87.11 μg/mL和0.36 mg/mL。

表1 不同质量浓度低分子肝素和磺达肝癸钠存在下APTT检测结果Table 1 APTTs of different concentrations of low-molecular-mass heparin and fondaparinux sodium

表2 不同质量浓度PTS存在下APTT检测结果Table 2 APTTs in the presence of different concentrations of PTS

表3 不同化合物抗凝血活性APTT检测结果Table 3 Anticoagulant activity of different compounds as determined according to APTTs

2.6 PTS存在情况下对TT的影响

由表4可知,空白对照组TT为(9.53±0.58)s。2~24 μg/mL的低分子肝素和8~128 μg/mL的磺达肝癸钠对TT有影响。由表5可知,在0~2 mg/mL范围内,PTS可剂量依赖性地延长质控血浆TT。对样品终质量浓度与TT均值进行线性拟合,并由拟合方程计算延长一倍TT所需样品质量浓度,结果见表6,人质控血浆TT延长一倍所需的低分子肝素、PTS质量浓度分别为5.01 μg/mL、0.14 mg/mL。

表4 不同质量浓度低分子肝素和磺达肝癸钠存在下TT检测结果Table 4 TTs in the presence of different concentrations of lowmolecular-mass heparin and fondaparinux sodium

表5 不同质量浓度PTS存在下TT检测结果Table 5 TTs in the presence of different concentrations of PTS

表6 不同化合物抗凝血活性TT检测结果Table 6 Anticoagulant activity of different compounds as determined according to TTs

2.7 PTS存在情况下对PT的影响

表7 不同质量浓度低分子肝素、磺达肝癸钠和PTS存在下PT检测结果Table 7 PTs in the presence of different concentrations of lowmolecular-mass heparin, fondaparinux sodium and PTS

表8 不同化合物抗凝血活性PT检测结果Table 8 Anticoagulant activity of different compounds as determined according to PTs

2.8 PTS对FIIa和FXa活力的影响

低分子肝素对抗凝血酶依赖的FXa活力半数抑制质量浓度(half-maximal inhibitory concentration,IC50)为(51.63±2.02)μg/mL,PTS对FXa的活力无影响(表格未列出)。由表9和图5可知,低分子肝素对抗凝血酶依赖的FIIa活力IC50为(0.06±0.00)μg/mL,随着低分子肝素、PTS质量浓度的增加,FIIa活力逐渐减小,PTS可剂量依赖性地抑制FIIa的活力,其IC50为(85.88±12.50)μg/mL,说明PTS是通过抑制FIIa活力即凝血酶活性来发挥其抗凝血作用。

表9 PTS对FIIa活力的影响Table 9 Effect of PTS on FIIa activity

图5 FIIa相对活力与样品质量浓度的线性拟合曲线Fig. 5 Linear fitting curve between relative FIIa activity and sample concentration

2.9 PTS对FeCl3诱导大鼠颈总动脉血栓模型的影响

由图6及表10可知,空白组颈部总动脉血管腔内无血栓结构形成,血栓面积率为0.05%,如绿色箭头所指,血管各层膜结构明显。模型组血管腔内明显可见有闭塞性血栓结构形成,血管组织结构异常,管腔内可见大量混合血栓,导致管腔狭窄,红色箭头所示为大量纤维蛋白,黑色箭头所示为红细胞及少量血小板,动脉内膜内皮细胞数量减少,中膜显著变薄,结构不明显,血栓面积率为86.85%。与模型组相比,PTS-LD和PTS-MD组血管腔内血栓结构有略微程度的减少,血栓面积率分别为78.84%和72.79%,而血栓通胶囊组和PTS-HD组血管腔内中可看出血栓结构较模型组明显减少,血栓面积率分别为50.69%和43.51%。PTS-LD和PTS-MD组对血栓形成的抑制率较低,分别为13.6%和16.2%,血栓通胶囊组和PTS-HD组对血栓形成有显著的抑制效果,其抑制率为39.7%和47.4%。

表10 各组药物对FeCl3诱导大鼠颈总动脉血栓模型的影响Table 10 Inhibitory effect of tested drugs on FeCl3-induced common carotid artery thrombosis in rats

图6 各组药物对大鼠血栓影响的苏木精-伊红染色切片图(100×)Fig. 6 Effect of tested drugs on rat thrombosis (100 ×)

3 结 论

本实验找到52 种已知的PFH成分,筛选出20 种有效成分。以这些成分为基础,得到PTS的有效成分-作用靶点网络图,发现PTS对FII和PTAFR两个靶点有作用,通过蛋白-蛋白相互作用图发现FII和PTAFR两个靶点主要参与凝血级联等反应通路,得到的FII和PTAFR对应的凝血机制通路图,进一步说明FII可能为PTS发挥抗凝血作用联系最紧密、可能性最大的靶点。

体外凝血3 项检测实验结果表明,在质量浓度2~32 μg/mL范围内,低分子肝素对APTT和TT的影响较大,对PT无显著影响,其延长人质控血浆APTT、TT一倍所需质量浓度分别为9.90 μg/mL和5.01 μg/mL,与对照组相比,其对内源性凝血途径和共同凝血途径影响较大,不影响外源性凝血途径。在质量浓度8~128 μg/mL范围内,磺达肝癸钠仅对APTT有显著影响,对TT和PT均无影响,其延长人质控血浆APTT一倍所需质量浓度为87.11 μg/mL,与对照组相比仅对内源性凝血途径有影响,对共同凝血途径和外源性凝血途径没有影响。上述研究结果与现有报道结果[29-31]一致,在质量浓度0~2 mg/mL范围内,PTS对APTT、TT有显著影响,可以剂量依赖性地延长人质控血浆的APTT和TT,对PT无影响,其倍增人质控血浆APTT、TT所需质量浓度分别为0.36 mg/mL和0.14 mg/mL,与对照组相比,PTS是通过影响内源性和共同凝血途径来体现其抗凝效果的。体外FIIa和FXa活力检测实验结果表明,PTS对FXa活力无影响,可剂量依赖性地抑制FIIa活力,其IC50为(85.88±12.50)μg/mL。

体内FeCl3诱导大鼠颈总动脉血栓模型影响的检测结果表明PTS-HD组可显著抑制大鼠颈总动脉血栓的形成,其血栓面积率为43.51%,抑制率为47.4%,抑制效果优于已上市阳性对照药血栓通胶囊组(血栓面积率为50.69%,抑制率为39.7%),说明PTS可以抑制FeCl3诱导的大鼠颈总动脉血栓形成。结合体外实验结果可以推测PTS的抗血栓作用是基于对凝血系统的抑制作用,即通过抑制凝血酶FIIa的活力从而抑制纤维蛋白凝块和局部血凝块形成来发挥抗凝血、抗血栓作用。

PTS的抗凝血活性已有前期的研究基础,通过体内外实验证实了PTS的抗凝血、抗血栓作用,并首次发现其抗凝血作用的靶点为内源性凝血途径上的FIIa。在后续的研究计划中,本课题组将尝试提取分离出总皂苷含量更高的PTS并分离制备出一系列单一的皂苷类化合物,以期得到未见报道的新皂苷类化合物以及探究单一皂苷类化合物是否较PTS具有更强更有效的抗凝血活性。

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