CFTR基因多态性与原发性肝内胆管结石发病风险的关系

梅 璇， 吴海聪， 林 静， 郑娇龙， 刘 邦， 李东良

解放军联勤保障部队第九〇〇医院(福建医科大学福总临床医学院) 肝胆内科， 福州 350025

原发性肝内胆管结石(primary intrahepatic lithiasis，PIL)是指发生于左右肝管分叉部以上的肝内各级分支胆管内的结石，属于原发性胆管结石的一种[1]。肝内胆管解剖结构的复杂性及结石大小、数量的多样性，易诱发反复胆道感染，长期发展可继发胆汁性肝硬化以及胆管癌等严重并发症，严重影响患者的生活和生存质量[2]。由于其发病机制尚未完全阐明，迄今仍缺乏满意的治疗药物和有效的预防方法[3]。流行病学研究[4]显示，不同种族、不同国家和地区人群该病发病率存在较大差异，这一现象提示PIL具有遗传易感性。因此，对易感基因筛查和功能研究已成为近年来关于PIL研究的一个重要方向。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2018年6月—2018年11月于本院门诊或住院的PIL患者作为病例组，并筛选同期健康体检者作为对照组。纳入标准：病例组患者诊断标准符合2016年《欧洲肝病学会临床实践指南：胆石病的预防、诊断和治疗》[11]。对照组为与病例组无血缘关系的非PIL的健康体检者。排除标准：(1)排除进行性家族性肝内胆汁淤积症、良性再发型肝内胆汁淤积症、妊娠期肝内胆汁淤积症等相关胆汁淤积性疾病；(2)排除胆囊结石及肝外胆管结石患者；(3)排除病毒性肝病(包括 HAV、HBV、HCV、EBV、CMV 和单纯疱疹病毒感染)；(4)排除有严重免疫缺陷者；(5)与已入组的病例或对照人群有亲缘关系者；(6)临床资料不完整的病例。

1.2 资料收集 用EDTAK2抗凝管收集研究对象外周血4 mL用于基因组DNA提取。资料采集内容包括：研究对象基本资料，肝内胆管结石情况，影像学检查结果，诊疗方法及疗效，既往病史等信息。

1.3 实验方法

1.3.1 主要试剂和仪器 2xTaq Master Mix(美国Vazyme公司)；引物(上海擎科生物工程有限公司)；基因组DNA提取试剂盒(美国omega公司)；台式高速离心机(德国 Eppendorf 公司)；ND-1000 紫外分光光度计(上海谱元仪器有限公司)；PCR 9700型扩增仪(美国ABI公司)；电泳仪(上海Tanon公司)；凝胶成像仪(上海Tanon公司)；3730XL测序仪(美国ABI公司)。

1.3.2 基因组DNA提取 采用美国omega公司的基因组DNA提取试剂盒，按照操作说明书提取外周血细胞中的基因组DNA，具体步骤参照产品说明书。应用紫外分光光度法对提取的基因组DNA的浓度及纯度进行测定。

1.3.3 基因位点的选择 以 CFTR基因作为本研究的目的基因，从Pubmed数据库中的文献、UCSC数据库中筛选并确定在国人中与疾病密切相关的Poly-T、TG-repeats和M470V位点为目标位点。

1.3.4 基因型鉴定 利用UCSC人类基因组数据库的In-Silico PCR工具确定引物序列(表1)。上海擎科生物工程有限公司进行引物合成及目标位点PCR扩增。将扩增产物送至上海欧易生物科技公司进行测序。

表1 CFTR基因3个位点正反向引物

1.4 伦理学审查 本研究通过解放军联勤保障部队第九〇〇医院伦理委员会批准，批号：2018-021，所有研究对象均签属知情同意书。

2 结果

2.1 一般资料 共纳入PIL患者104例，男34例，女70例，平均(59.32±14.35)岁。对照组120例，男72例，女48例，平均(48.47±12.65)岁。2组研究对象年龄、性别差异均有统计学意义(P值均<0.05)(表2)。

2.2 Hardy-Weinberg 平衡检验 PIL组3个位点及对照组TG-repeat、Poly-T位点基因型频率均符合Hardy-Weinberg平衡(P值均>0.05)。对照组M470V位点上基因型频率偏离Hardy-Weinberg 平衡(χ2=17.59，P<0.05)。

因此，采用ORadj表示基因型与发病风险的关系。经平衡校正后，携带有等位基因G的个体(AG、GG)较AA纯合型个体发生PIL的风险升高(OR>1)，随着等位基因G的个数增加，患病风险逐渐升高(ORGG：4.68>ORAG：2.50)(表3)。

表2 研究对象的一般资料

表3 PIL组与对照组M470V位点基因型比较

表4 PIL组和对照组3个位点等位基因分布

表5 PIL组和对照组3个位点基因型分布

表6 PIL组和对照组TG-repeat、Poly-T多态性位点的单倍体基因型分布

2.3 CFTR基因中三个多态性位点的等位基因及基因型分布 PIL组和对照组间3个位点的基因分析结果显示：M470V位点上的等位基因(χ2=15.139，P<0.01)和基因型(χ2=22.889，P<0.01)在2组间差异均有统计学意义。TG-repeat、Poly-T两位点上等位基因及个体基因型在2组间差异均无统计学意义(P值均>0.05)(表4、5)。

2.4 CFTR基因多态性与PIL的关系 M470V位点上，等位基因G携带者的PIL发病风险升高(OR=2.108，P<0.01)(表4)。TG-repeats位点上，12TG/13TG基因型个体发生PIL的风险较11TG/12TG基因型个体升高(OR=11.002，P<0.05)。Poly-T位点上，7T/5T基因型个体发生PIL的风险较7T/7T基因型个体降低(OR=0.079，P<0.05)(表5)。

2.5 CFTR基因TG-repeat、Poly-T两个多态性位点的单倍体基因型分析 11TG-7T、12TG-7T单倍体基因型在PIL患者当中所占比例最高，分别为45.2%和51.0%。TG-repeats和Poly-T位点的各种单倍体基因型在PIL组和对照组间频率差异均无统计学意义(P值均>0.05)(表6)。

3 讨论

此前，在其他疾病中已证实TG-repeats、Poly-T位点多态性与疾病表型相关[20]。TG-repeats是位于CFTR基因核苷酸链上内含子8与外显子9之间的一段TG碱基重复序列，参与内含子8与外显子9的剪接，TG重复序列越长，功能正常的CFTR蛋白数量越少[19]。在本研究中，12TG/13TG基因型个体的PIL易感性比11TG/12TG个体更高(OR=11.002，P<0.05)。这与Salinas等[21]在非PIL疾病研究中发现TG重复序列越长越容易致病的研究结果一致。Poly-T是与位点TG-repeats紧邻的T碱基重复序列，碱基T重复次数越少，正常的CFTR蛋白数量越少[9]。Jiang等[22]研究认为IVS8-5T是慢性胰腺炎的危险因素。反之，Qiao等[23]却发现5T在前列腺癌发病过程中起保护作用。在本研究中，7T/5T个体较7T/7T发生PIL的风险更低(OR=0.079,P=0.047)。不同种族及地域人群的CFTR基因多态性存在差异[4]，因此，本研究与既往部分研究结果不相符可能是由于纳入的研究对象遗传背景不同所致。

本研究目前仅局限于基因层面，尚无蛋白质分子水平的证据，即使基因异常却仍有可能出现编码蛋白不致病可能，因此需进一步对CFTR基因参与的信号通路及编码的蛋白产物加以研究探索。另外，本研究为单中心研究，样本量有限，难免存在选择偏倚，研究结果未来还需在更大样本量及不同种族、地域人群中进行验证。

肝内胆管结石的发病不是单一因素所致，而是由多因素共同作用。本研究结果证实了汉族人群中CFTR基因的M470V位点和PIL易感性之间的相关性。然而目前CFTR基因多态性在PIL发病过程中的分子作用机制尚未完全明确。未来仍需进一步的研究来阐释其多态性在PIL中的具体致病机制。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献声明：梅璇负责课题设计、研究实施、数据分析以及论文撰写；吴海聪、林静负责资料收集、数据分析；郑娇龙、刘邦负责数据整理；李东良负责课题设计、研究指导、论文修改。