高剂量糖皮质激素对大鼠糖代谢的影响

赵晴晴， 周金鑫， 潘 昱， 琚卉君， 朱丽颖， 刘 瑒， 张一帆

（上海交通大学医学院附属瑞金医院核医学科，上海 200025）

糖皮质激素（glucocorticoid，GC）因其高效的抗炎、抗过敏和免疫抑制作用，在临床众多领域中具有不可替代的作用，如多发性骨髓瘤、淋巴瘤以及原发性免疫性血小板减少症都需要应用大剂量GC治疗[1]。然而，过多的GC常易引发糖代谢紊乱[2]。研究显示，无明确糖尿病史的患者在使用GC后，32.2%的患者出现血糖升高（随机血糖＞11.1 mmol/L），严重影响了患者的生活质量，降低生存率[3]。

GC引起糖代谢紊乱的机制尚不清楚，主要认为与胰岛β细胞破坏和外周胰岛素抵抗有关[4]。Ruzzin等[5]通过每天给予Wistar大鼠腹腔注射1 mg/kg的地塞米松12 d，建立骨骼肌胰岛素抵抗模型，但大鼠血糖水平仅表现为轻度增高（5.5 mmol/L比5.1 mmol/L）。Ogawa等[6]研究显示，通过每天腹腔注射5 mg/kg地塞米松，第15天时16%的Wistar大鼠发展为糖尿病。目前，高剂量GC对糖代谢的影响研究较少，GC引起糖代谢紊乱机制的研究局限于离体条件下，对活体条件下组织器官的葡萄糖代谢状况尚不清楚。

18F-氟代脱氧葡萄糖（fluorodeoxyglucose，FDG）正电子发射体层成像 （positron emission tomography，PET）/CT显像是利用18F-FDG与葡萄糖具有相似的生物化学特性，能通过细胞膜上的葡萄糖转运体进入细胞，在己糖激酶的作用下磷酸化生成6-PO4-18F-FDG而滞留在细胞内，从而可以在活体条件下反映组织器官葡萄糖的代谢水平[7]。本研究通过18F-FDG PET/CT显像观察Wistar大鼠在高剂量GC条件下，各组织器官的葡萄糖摄取状况，了解高剂量GC对机体葡萄糖代谢的影响。

材料和方法

一、实验动物

60只实验大鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司，在上海交通大学医学院附属瑞金医院实验动物中心饲养并维持为无特定病原体的动物。温度控制在22～24°C，光照从早上7∶00开始，12 h光照加12 h黑夜，食物（上海斯莱克实验动物有限公司）和水充足。该研究经我院动物实验委员会批准，并按照动物实验责任机构委员会的伦理标准进行。

二、实验方法

1.不同剂量地塞米松实验分组：雄性Wistar大鼠200 g，30只，在适应性喂养1周后采用随机数字表法将大鼠分为5组，每组6只。未注射地塞米松组为组1（对照组），另外4组腹腔注射不同剂量的地塞米松（0.01、0.02、0.1、1 mg/kg），分别为组2～5。5组大鼠每隔1 d监测体重、空腹血糖（fasting blood glucose，FBG），每周进行1次糖耐量试验（glucose tolerance test,GTT）。给药9 d后，FBG结果提示给药剂量梯度设置偏低，后将组2给药浓度改为10 mg/kg，组3给药浓度改为5 mg/kg，又观察16 d。给药21 d以后，血糖变化趋于稳定，GTT仅测至第3周，后续未再进行GTT实验。

2.高剂量地塞米松分组：30只雄性Wistar大鼠（250～300 g），适应性喂养1周后采用随机数字表法分为2组。5只为对照组，每天腹腔注射相应剂量的0.9%氯化钠注射液。25只为实验组，每天腹腔注射地塞米松（10 mg/kg），其中5只用于眼眶采血，5只用于GTT，5只用于胰岛素耐量试验（insulin tolerance test，ITT），10只用于小动物PET显像。但由于实验过程中部分大鼠麻醉死亡、血液样本发生溶血或显像失败等原因，眼眶采血、GTT、ITT大鼠为4只，PET显像为5只。每隔1 d监测体重和FBG变化，并在建模的第0、3、7、11、15天，进行眼眶采血、GTT、ITT和PET显像。实验结束后，对照组和实验组各5只，解剖取骨骼肌和肝脏，进行苏木精-伊红（hematoxylin and eosin，HE）染色和过碘酸希夫（periodic acid Schiff，PAS）染色。

三、FBG、胰岛素、GTT和ITT

1.FBG和胰岛素：大鼠禁食12 h后抽取大鼠尾尖血液，使用拜安进自动血糖仪（Contour TM TS,德国拜耳公司）检测其FBG[8]。禁食12 h后，麻醉下进行大鼠眼眶采血[9]，血液经4°C 2 000×g离心20 min，取上清，-80°C冰箱保存。通过胰岛素试剂盒（购自美国Crystal Chem公司）检测血清胰岛素[10]。

2.GTT：大鼠禁食不禁水过夜后，测量基础体重及FBG值，腹腔注射50%葡萄糖溶液（1 g/kg）给予糖负荷。血糖仪测定糖负荷后30、60、90和120 min各点血糖值，绘制血糖变化曲线，计算血糖曲线下面积（area under curve，AUC）并进行统计分析。

3.ITT：大鼠禁食不禁水过夜后，腹腔注射1 U/mL的胰岛素（1 U/kg）。分别在胰岛素注射的第0、15、30、60和90 min测量血糖值，并取自然对数，计算随时间变化下降斜率，乘以100，得到KITT值[11]。

四、PET/CT显像

将10只实验组大鼠在建模的第0、3、7、11、15天过夜禁食12 h，腹腔注射3%戊巴比妥钠[购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司，30 mg/kg]麻醉后，尾静脉注射18F-FDG 7.4 MBq，30 min后，大鼠俯位固定于微PET/CT（Inveon MM Platform,Siemens Preclinical Solutions,Knoxville，美国）扫描床视野的中心位置，并于麻醉状态下进行扫描。PET/CT设备分辨率为1.5 mm，孔径5.7 cm，轴向8.5 cm视野。微PET/CT设备采集工作站为Inveon Acquisition Workplace（IAW）1.5.0.28，数据采集前建立新的工作流（workflow），包含CT采集、重建，PET采集,PET直方图 和PET重建。在80 kV电压、500μA电流和1 100 ms曝光条件下CT扫描10 min，然后采集PET数据。采集的数据利用IAW软件经过衰减校正，通过三维有序子集最大期望值法（three-dimensional ordered subset expectation maximization，3DOSEM）重建冠状面、横断面、矢状面断层图像进行分析。重建后的图像利用西门子IRW 3.0获取3D的感兴趣区（regions of interest,ROI），骨骼肌选取两上肢滑车上肘肌区[12]，肝脏选取右上叶，最后对数据进行定量分析并获取ROI的%ID/g最大值[13]。

五、统计学方法

使用GraphPad Prism Version 7软件进行数据的图表绘制。所有计量资料以x±s表示；多组间比较采用方差分析，两组间比较采用Student’st检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

一、不同剂量地塞米松对大鼠糖代谢的影响

地塞米松0.01、0.02 mg/kg 9 d时，大鼠体重分别为（242±13）g、（238±7）g，与组1[（251±13）g]相仿（均P＞0.05）；地塞米松0.1、1 mg/kg时，大鼠体重9 d时分别为（225±10）g、（196±9）g，较组1差异有统计学意义（P=0.003 8，P＜0.000 1）。第25天体重分别为（302±26）、（242±18）、（192±11）、（188±11）、（177±10）g，与组1相比差异有统计学意义（均P＜0.01）（见图1 A）。低剂量（0.01～0.1 mg/kg）地塞米松对大鼠FBG无明显影响，仅0.02 mg/kg地塞米松第3天FBG[（3.4±0.3）mmol/L比（5.0±0.3）mmol/L]有所降低（P＜0.000 0）；组5给药后FBG[（6.1±0.9）mmol/L]较给药前[（4.9±0.6）mmol/L]轻微增高（P=0.001 5）。组3和组2后期（5 mg/kg和10 mg/kg地塞米松）干预后血糖升高，第20、23、25天血糖组2为（6.7±1.7）、（6.5±2.2）、（8.0±2.8）mmol/L，组3为（5.7±0.6）、（5.6±1.3）、（6.7±1.6）mmol/L，与给药前相比差异有统计学意义（均P＜0.05）（见图1B）。7 d GTT多组间方差分析，F=14.97，P＜0.000 1。GTT组3（600±77）和组4（572±78）给药7 d时与组1（756±46）相比AUC降低（P=0.001 6，P=0.000 5）（见图1 C）；14 d GTT多组间方差分析，F=27.92，P＜0.000 1。给药14 d组4（565±44）、组5（640±72）AUC较组1（758±38）低（P=0.000 09，P=0.008 3）；组2（869±64）、组3（1 117±194）较组1（758±38）高（P=0.006 1，P=0.005 6）（见图1D）。21 d GTT多组间方差分析，F=13.08，P＜0.000 1，给药21 d仅组2（1 169±233）较组1（753±71）高（P=0.006 1）（见图1 E）。10 mg/kg地塞米松给药14 d和21 d，AUC分别为（869±64）和（1 169±233），与5 mg/kg地塞米松给药后相比差异有统计学意义（P分别为0.004 4和0.001 9）（见图1D、E）。

图1 不同剂量地塞米松对大鼠糖代谢的影响

二、高剂量地塞米松对大鼠糖代谢的影响

高剂量地塞米松干预后，实验组体重第0、3、7、11、15天为（261±8）、（226±8）、（192±10）、（172±10）、（156±10）g,与干预前相比差异有统计学意义（均P＜0.05）（见图2A）。FBG第0、3、7、11、15天为（4.3±0.8）、（14.4±5.2）、（8.3±2.6）、（9.8±4.4）、（9.8±4.9）mmol/L，与干预前相比差异有统计学意义（均P＜0.05）（见图2B）。空腹胰岛素与干预前[（0.8±0.2）μg/L]相比，第3天[(11.6±1.1)μg/L](P=0.000 4)、第7天[(9.2±1.0)μg/L](P=0.000 5)、第11天[(9.2±2.4)μg/L](P=0.009 0)和第15天[(13.5±2.1)μg/L](P=0.017 1)（见图2C）。GTT结果显示：实验组大鼠与干预前（858±26）相比，第3天（2 350±345）（P=0.003 1）、第7天（1 680±331）（P=0.015 4）、第11天（1 352±166）（P=0.008 6）和第15天（1 553±217）（P=0.007 2）血糖AUC明显升高（见图3 A）。ITT结果显示：实验组大鼠与干预前（1.26±0.18）相比，第3天（0.51±0.09）（P=0.001 2）、第7天（0.91±0.18）（P=0.033 2）、第11天（0.77±0.16）（P=0.006 9）和第15天（0.50±0.16）（P=0.000 7）KITT值明显降低（见图3 B）。

图2 高剂量地塞米松对大鼠糖代谢的影响

图3 实验组大鼠GTT和ITT

三、PET/CT显像中骨骼肌和肝脏FDG摄取

实验组大鼠PET/CT结果示，第3（0.15±0.03）（P=0.029 2）、7（0.20±0.02）（P=0.001 7）、11（0.28±0.02）（P=0.000 4）、15天（0.27±0.03）（P=0.000 5）骨骼肌葡萄糖摄取%ID/g最大值均高于第0天（0.10±0.01）（见图4A）。肝脏葡萄糖摄取第0、3、7、11、15天%ID/g最大值分别为0.23±0.01、0.27±0.05、0.31±0.02、0.35±0.07、0.31±0.05，其中7天与第0天相比差异有统计学意义（P=0.015 4）（见图4B）。

图4 实验组大鼠PET/CT显像骨骼肌和肝脏葡萄糖摄取（%ID/g最大值）

四、免疫组化

实验组大鼠骨骼肌HE染色结果显示骨骼肌肌纤维出现萎缩显像，细胞核堆积（见图5A、B）；PAS染色显示糖原含量增加（见图5C、D）。实验组大鼠肝脏HE染色结果显示肝脏脂肪浸润增多（见图5E、F）；PAS染色显示肝脏糖原含量增加（见图5G、H）。

图5 大鼠骨骼肌和肝脏HE和PAS染色（100×）

讨 论

不同剂量地塞米松腹腔注射对大鼠体重均有一定的影响，给药剂量为1 mg/kg时，大鼠即表现为体重减轻、消瘦，给药剂量越大，体重减轻越明显。研究显示，不同高剂量的地塞米松干预，大鼠均呈现一定程度的体重减轻[14-15]。不同剂量地塞米松干预可引起大鼠血糖的改变，其中高剂量地塞米松可引起血糖明显升高，AUC明显升高，糖处理能力下降，KITT值降低，外周胰岛素抵抗明显。本实验中选用10 mg/kg的地塞米松干预15 d以观察高剂量地塞米松对大鼠糖代谢的影响。

GC引起糖代谢紊乱的机制主要与胰岛β细胞功能改变及外周胰岛素抵抗有关[16-17]。体外研究显示，GC引起胰岛β细胞凋亡[18]，及抑制胰岛素生物合成和释放[19]。然而，体内研究显示GC干预后，由于机体的代偿作用会导致胰岛β细胞功能和质量增加[20]。本研究中高剂量地塞米松干预后，大鼠呈现明显高胰岛素血症。Fine等[21]通过可的松（200 nmol/L）或皮质醇（20 nmol/L）处理小鼠离体胰岛48 h，结果显示生理剂量的GC通过上调环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）促进胰岛素分泌。Courty等[20]研究显示，长期GC干预后，由于机体的代偿作用会导致胰岛β细胞功能和质量增加。Protzek等[11]研究通过1 mg/kg地塞米松连续干预5 d，大鼠和小鼠均表现为β细胞功能增强（葡萄糖刺激的胰岛素分泌增多）和数目增加（胰岛β细胞代偿性增生）。可见，高剂量GC干预会引起胰岛素分泌增加。

Rafacho等[22]通过Wistar大鼠1 mg/kg地塞米松干预1～5 d，发现地塞米松以时间依赖性引起胰岛素抵抗，胰岛β细胞增生和胰岛素分泌；通过连续5 d使用不同剂量（0.1～1 mg/kg）的地塞米松，发现地塞米松呈剂量依赖性引起高胰岛素血症和胰岛素抵抗，而不伴明显的高血糖现象[23]。本研究中高剂量地塞米松干预后，大鼠血糖明显升高，AUC升高，KITT值降低，胰岛素抵抗。可见，高剂量的GC干预会引起胰岛素抵抗。

本研究通过PET/CT显像观察到实验大鼠组织器官葡萄糖代谢状况，骨骼肌葡萄糖摄取逐渐增加，肝脏葡萄糖摄取变化不明显。在骨骼肌，胰岛素介导超过80%的葡萄糖摄取[24]。研究显示过量GC可直接干扰骨骼肌细胞中的胰岛素信号转导，抑制葡萄糖转运体4转运至细胞膜上，减少骨骼肌胰岛素刺激的葡萄糖摄取和糖原合成[25-26]。本研究中ITT结果也显示外周存在胰岛素抵抗，然而骨骼肌FDG摄取增加，可能与胰岛素分泌增多有关。Nicod等[27]给予健康非肥胖患者2 mg/d地塞米松干预2 d，通过治疗前后葡萄糖钳夹试验，发现给予地塞米松后，胰岛素代偿性分泌增多补偿了骨骼肌胰岛素抵抗。Burén等[28]研究发现1 mg/kg地塞米松干预11 d后，大鼠骨骼肌胰岛素刺激的葡萄糖摄取减少，而不伴有基础葡萄糖摄取减少。Ruzzin等[5]研究显示1 mg/kg地塞米松干预12 d可引起大鼠骨骼肌胰岛素抵抗的发生，但骨骼肌和肝脏糖原含量增加。本研究中实验组大鼠骨骼肌和肝脏糖原含量增加，说明高剂量GC引起的高胰岛素血症补偿了骨骼肌胰岛素抵抗。

肝脏在调节葡萄糖和脂质稳态中起关键作用。GC可以引起肝脏脂肪沉积，胰岛素抵抗，本研究中也观察到高剂量地塞米松干预后脂肪含量增加。高剂量地塞米松可引起明显的高胰岛素血症，尽管胰岛素不直接刺激肝细胞摄取葡萄糖，但其通过调节糖原合成和糖异生维持血糖稳定。本研究中观察到肝脏FDG摄取变化不明显，可能原因一是肝脏摄取葡萄糖通过葡萄糖转运蛋白2，不依赖于胰岛素[29-30]；二是过量GC可促进肝脏糖异生的限速酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶及葡萄糖-6-磷酸酶活性增强，导致肝脏葡萄糖输出增加[31]。但同时血糖升高时，会反馈抑制肝细胞内葡萄糖-6-磷酸酶的活性，使已经被己糖激酶磷酸化后的6-磷酸-FDG不能及时脱去磷酸释放入血而滞留于肝脏内[32]。因此，肝脏葡萄糖摄取变化不明显，提示高剂量GC引起的高胰岛素血症不能完全补偿肝脏葡萄糖代谢缺陷。

综上所述，高剂量GC会引起大鼠体重减轻，血糖和胰岛素水平升高，糖耐量异常，胰岛素抵抗发生。高剂量GC引起的高胰岛素血症补偿了骨骼肌胰岛素抵抗，但由于GC引起肝脏内源性葡萄糖的产生，不能完全补偿肝脏葡萄糖代谢缺陷。