标准化工艺条件下大河乌猪火腿发酵过程中的挥发性风味物质变化

李钰芳，施娅楠，魏光强，李祥，黄艾祥*

（1.云南农业大学食品科学技术学院，云南昆明 650201）（2.云南东恒经贸集团有限公司，云南曲靖 655000）

大河乌猪是由云南富源大河猪与“杜洛克”公猪杂交育成的国家级新品种，肌肉间脂肪含量高达5%，以肉质优良、营养丰富、风味独特而著称[1]，是生产优质火腿的理想材料。火腿风味是消费者判断其质量和可接受度的重要属性之一[2-3]，而发酵是火腿风味形成的关键阶段[4]，作为传统腌腊肉制品杰出代表的火腿，对其挥发性风味物质已经展开了大量研究。章建浩等[5]在传统工艺金华火腿中共检出78 种挥发性风味物质，加工过程中醛和酮的相对含量逐渐降低，羧酸、酯、吡嗪和含硫化合物的相对含量逐渐增加；王嫒嫡等[6]发现传统工艺制作的宣威火腿随着发酵成熟时间的延长火腿的特征性风味物质含量增加，风味趋好；Giovanelli 等[7]比较了帕尔马、圣丹尼和托斯卡诺火腿发酵过程中理化、形态和芳香特征的演变，发现随着加工时间延长，火腿风味物质更加丰富，香气进化明显；施娅楠等人[8]发现传统工艺条件下大河乌猪火腿随着发酵期的延长，风味成分的含量逐渐增加。

我国传统干腌火腿属于自然发酵肉制品，生产工艺复杂且标准化程度较低，其生产过程均在自然条件下进行，通常是按季节、气候控制生产时间，对环境温度、湿度、用盐量、腌制时间等因素的控制并不精准且生产者技术经验也存在较大差异，很大程度上限制了火腿的品质和统一性，这也是造成国内干腌火腿与国际干腌火腿存在差距的最重要原因之一[9]。西式火腿大多采用标准化工艺对火腿进行加工，通过控温、控湿等功能，保证火腿在加工过程中始终处于最佳环境中，减少火腿变质情况，缩短发酵时间[10]，能够保证火腿的品质。

标准化工艺条件即在低温高湿（3±1 ℃、RH=85%～90%）条件下对火腿进行冷凉后熟、修割整形、上盐腌制等加工，并在中温高湿（6±1 ℃、RH=70%～75%）脱水平衡，最后高温高湿（23±1 ℃、RH=65%）下发酵产香得到成熟火腿。本研究以标准化工艺条件生产的大河乌猪火腿为研究对象，研究发酵时间（90 d、150 d、210 d、270 d、450 d、630 d）对火腿挥发性风味物质的影响，以期为大河乌猪火腿的标准化、科学化生产奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大河乌猪火腿10±1 kg，云南东恒经贸集团有限公司提供。

1.2 仪器与设备

火腿标准化生产车间，云南东恒经贸集团有限公司；固相微萃取装置及SPME 萃取头（50/30 µm DVB/CAR/PDMS），美国supelco 公司；7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪，美国agilent 公司；JJ-2BS 组织捣碎机，常州峥嵘仪器有限公司；超低温冰箱，艾本德（上海）国际贸易有限公司；20 mL 透明顶空萃取瓶，上海安谱科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大河乌猪火腿的标准化生产工艺

172 只新鲜后腿→冷凉后熟18 h（3±1 ℃、RH=85～90%）→修割整形→上盐腌制24 d（腌制方法：采用上盐堆码干腌制，按每只鲜腿重的5.5%称取食盐，再按食盐总重50%、30%、20%比例，分别在第1、3、5 d 搓揉上盐并翻堆后堆码腌制；腌制条件：3±1 ℃、RH=85～90%）→中温脱水平衡60 d（6±1 ℃、RH=70%～75%）→高温发酵产香90 d～630 d（23±1 ℃、RH=65%）→ 成熟火腿

1.3.2 火腿采样

从发酵时间为（90 d、150 d、210 d、270 d、450 d、630 d）的6 个组中分别随机抽取4 只火腿，共计24只火腿，将半膜肌和股二头肌按1:1 的比例混合，组织捣碎机搅碎后真空包装并保存在-20 ℃备用，每个发酵周期结束后立即对样品进行测定。

1.3.3 挥发性风味物质萃取及GC-MS 条件

顶空固相微萃取条件：参照Huan 等[11]的方法，称取肉样5.00 g 于20 mL 顶空瓶中；将老化后的50/30µm 萃取头插入顶空瓶上部，于50 ℃吸附40 min，吸附后的萃取头取出后插入GC 进样口，于210 ℃解析5 min，同时启动仪器采集数据。

GC-MS 参数参考郇延军等[12]和Petričevića 等[3]的方法并稍作修改。GC 条件：色谱柱：DB-5 MS 毛细色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 µm）；升温程序：40 ℃保持5 min，以5 ℃/min升至90 ℃，再以12 ℃/min升至250 ℃并保持7 min；载气He（纯度≥99.999%）；流速1.0 mL/min；进样口温度250 ℃；进样量0.5 µL；分流比1:30。

MS 条件：传输线温度280 ℃，离子源EI，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，电子能量70 eV，质量扫描范围50～450m/z。

1.3.4 挥发性风味物质的鉴定

参照王勇勤等[13]和高韶婷等[14]的方法对挥发性物质进行定性和定量分析。

挥发性物质的定性：将测得各挥发物的谱图与NIST 2008 和Wiley 9 谱库中标准物质的谱图进行比对，仅报道正反匹配度均大于800（最大值为1000）的结果；同时计算各挥发物的保留指数（retention index，RI）并与文献中的RI 进行比对，RI 的计算公式如下式：

式中：

Rt(x)——待测挥发性成分的保留时间，min；

Rt(n)——含n个碳原子正构烷烃的保留时间，min；

Rt(n+1)——n+1 个碳原子正构烷烃的保留时间，min。

挥发性物质的定量：采用峰面积归一化法。

1.3.5 关键挥发性物质评定方法[15]

采用相对香气活度值法（relative odor activity value，ROAV），

式中：

ROAVi——某挥发性风味物质的相对气味活度值；

Ci——某挥发性风味物质的相对含量；

Tstan——气味贡献最大挥发性风味物质的阈值；

Cstan——气味贡献最大挥发性风味物质的相对含量；

Ti——某挥发性风味物质的阈值。

1.4 数据分析

采用Microsoft Excel 2010 以峰面积归一化法，计算各挥发性化合物的相对含量，结果输出形式以x±s计。SIMCA 14.1 进行偏最小二乘-判别分析（PLS-DA）分析。

2 结果分析

2.1 大河乌猪火腿发酵过程中挥发性化合物的变化

大河乌猪火腿在发酵过程中挥发性风味成分变化见表1 和表2，发酵过程中共鉴定到137 种挥发性化合物，发酵的6 个时期（90 d、150 d、210 d、270 d、450 d 和630 d）挥发性风味成分种类分别为45、31、62、54、72、68 种，主要以醛类（51.63%～68.17%）、醇类（12.73%～23.64%）和烃类（1.50%～15.50%）为主，它们的变化初步反映了火腿风味的形成过程。

表1 发酵过程中火腿挥发性风味成分Table 1 Volatile flavor components of ham in the process of ham fermentation

续表1

续表1

续表1

表2 火腿发酵过程中挥发性风味成分的种类及相对含量Table 2 Variety and relative content of volatile flavor components during ham fermentation

火腿中已鉴定出的醛类包括直链醛、二醛、烯醛、支链醛和芳香醛5 种类型，不论猪肉或羊肉火腿，醛类物质是被分离鉴定出的含量最丰富、种类最多的挥发性风味物质[16-17]。醛类是大河乌猪火腿每个发酵阶段都占优势的1 种挥发性风味成分，6 个发酵期醛类物质含量都超过挥发性风味成分总量的一半以上，Sabio 等[18]研究发现，Bayonne、Corsican、Iberian、Parma 和Serrna 火腿中的醛类物质在挥发性风味成分中占比最多，其含量达50%以上，要萍等[19]研究发现以传统方法加工的宣威火腿中最丰富的挥发性风味物质为醛类物质，与本研究结果类似。在大河乌猪火腿6 个发酵期中醛类含量最丰富的是己醛（13.01%～40.15%），其次是壬醛（1.01%～15.17%），壬醛是油酸的氧化产物[20]，能够带来高度愉快的甜味或果香风味特征，己醛是亚油酸的氧化产物[21]，呈现清香的青草气味，此研究结果与伊斯特拉火腿和宣威火腿的风味物质相似[22-23]。发酵至210 d 时，火腿中的醛类物质有18 种，在6 个发酵期中种类最丰富，比发酵90 d时新增7 种醛类物质，该结果与硗碛火腿[24]的发酵过程相似，硗碛火腿发酵至225 d 时比发酵初期新增加7种醛类物质，说明发酵时间对醛类物质的产生有一定的影响。

醇类物质大多数来源于脂质氧化分解，因为原料肉中醇含量不高[25]，在火腿的整个发酵过程中，发酵至210 d 时醇类物质的相对含量最丰富，其相对含量达到23.64%，从发酵90 d 至450 d，醇类物质种类增加8 种但相对含量减少2.58%，该结果与李诚[24]研究的跷碛火腿发酵过程中醇类物质相对含量从10.0%下降到2.45%的结果类似，这可能是由于腌制时用盐量过多造成[26]，在大河乌猪火腿发酵210 d、270 d、450 d、630 d 四个时期含量最丰富是1-辛烯-3-醇，1-辛烯-3-醇阈值很低且能赋予食品蘑菇的香气，是金华火腿中最重要的风味成分之一，对火腿风味有非常重要的作用[27]。

大河乌猪火腿不同发酵期共鉴定得到30 种烃类物质，相对含量在1.50%～15.50%间波动，发酵至150 d 时，能检测到的烃类物质只有2,4-二甲基庚烷，发酵至630 d 时烃类物质种类最丰富，共检测出20 种烃类物质，其相对含量为14.66%。郑璞等[28]在传统工艺

加工的盘县火腿中共检测出2 种烃类物质，含量在0.61 μg/kg 至5.73 μg/kg 之间变化；高韶婷等[14]在金华火腿中共检测到6 种烃类物质，相对含量在0.01%～0.02%之间；与盘县火腿和金华火腿相比，大河乌猪火腿中的烃类物质较多，但由于烃类物质的阈值较大，一般认为对腌腊制品的风味贡献不大[29-30]。

酯类由游离脂肪酸和肌肉组织内脂类氧化产生的醇反应生成，代表成熟肉制品的风味，对火腿风味特征有较大贡献。大河乌猪火腿中共检测出13 种酯类物质，发酵至210 d 酯类物质种类最多，乔发东等[31]研究发现随着宣威火腿加工时间的延长，酯类物质种类增加，与本研究结果类似，发酵时间可能对酯类物质的形成有一定的影响。其次，内酯类物质对火腿的风味具有非常重要的作用，赵冰等[32]检测出γ-己内酯、γ-丁内酯为特级金华火腿中的特征风味物质，在大河乌猪火腿中共检测出4 种内酯类物质（γ-丁内酯、γ-己内酯、γ-十二内酯、γ-壬内酯），且都是发酵至210 d 才开始被检出，推测内酯类物质可能受发酵时间影响较大。

酮类物质具有青香气味或奶油味、果香味，其中不饱和酮是动物特征味和植物油脂味的来源，是干腌火腿风味的重要组成部分[33]。大河乌猪火腿发酵的6个阶段，酮类物质相对含量和种类不断变化，发酵至210 d 时酮类物质相对含量和种类最丰富，共检测到6种酮类物质，相对含量为14.06%。酮类物质作为一种羰基化合物，它的相对含量比醛类少，阈值也比同分异构体的醛类物质高[30]，因此对干腌火腿风味的贡献小于醛类，但有增强风味的作用。

酸类化合物主要可能来自于火腿中磷脂和总三酯酰甘油的降解，其阈值较高，对食品风味没有直接的影响[34]，大河乌猪火腿发酵成熟的六个时期酸类物质一直存在，相对含量在1.36%～5.01%间变化，种类呈先上升后下降的趋势，要萍等人[19]在宣威火腿中只有检测到一种酸类物质；章建浩等人[5]的研究发现，传统工艺金华火腿中酸类物质随着发酵的进行，酸类物质种类和相对含量都增加，与本研究结果不同，可能是由于工艺和猪肉品种引起的差异。

大河乌猪火腿中共检测到6 种芳香族化合物，苯类物质同烷烃类一样具有较高的阈值，对火腿风味贡献较小[29]。其他类共检测出17 种，包括呋喃、吡嗪和一些杂环化合物，且这些物质种类和含量都是随着发酵期的延长逐渐增加，吡嗪类化合物共检测到4 种，主要来自于美拉德反应，是干腌火腿中重要的挥发性风味物质，通常赋予肉品坚果及烘烤香味[14]。

2.2 PLS-DA 分析发酵时间对大河乌猪火腿挥发性风味物质的影响

PLS-DA 结果（见图1），累计R2X＝0.866，R2Y=0.948，Q2＝0.807，Hotelling 图显示（见图2）所有样品均处于95% Hotelling T2置信区间内，没有发现“离群样本点”，说明该模型有较好的预测能力。从样本的聚集、离散程度看来，发酵至210 d、270 d、450 d、630 d 的样本聚集在一起，说明这四个时期挥发性风味物质的组成相似，主体风味成分在发酵至210 d 就已基本形成，传统工艺发酵的大河乌猪火腿在发酵至210 d时主体风味成分已基本形成，与本实验结果类似[8]。PLS-DA 是基于降维的多维向量分析方法，与PCA 不同的是，PLS-DA 为有监督的分析，可以预设分类，弥补了PCA 方法的不足，强化组间的差异，同时可以量化特征化合物造成组分差异的程度[35-36]。

图1 发酵过程中挥发性风味成分PLS-DA 得分图Fig.1 PLS-DA score map of volatile flavor components during fermentation

图2 发酵过程中挥发性风味成分Hotelling T2分布图Fig.2 Distribution of Hotelling T2 of volatile flavor component during fermentation

2.3 ROAV 分析发酵时间对大河乌猪火腿关键风味物质的影响

如表3 所示，大河乌猪火腿的关键风味化合物（ROAV≥1）有16 种：1-庚醇、3-甲基-1-丁醇、3-甲基丁醛、桉树醇、2,3-辛二酮、2,4-癸二烯醛、苯乙醛、己醛、辛醛、壬醛、(E)-2-壬烯醛、1-辛烯-3-醇、2-辛烯醛、芳樟醇、庚醛、2-戊基呋喃，与金华火腿和伊比利亚火腿的关键风味化合物类似[37-38]，与唐静等人[9]研究的强化高温火腿中的11 种特征关键风味化合物相似。在发酵的六个时期火腿的关键风味化合物（ROAV≥1）种类分别为：11 种、9 种、13 种、9 种、12 种、11 种，其中，1-庚醇、2,3-辛二酮、庚醛、己醛、辛醛、壬醛、2-辛烯醛存在于大河乌猪火腿发酵的六个时期，除了未查到阈值的化合物，在大河乌猪火腿成熟的六个发酵时期中，ROAV 值最大的均为醛类，已有研究证明，醛具有较低的气味阈值，存在于较高的数量，对干腌火腿的整体风味起着重要的作用[39-40]。

由表3 可知，发酵至90 d，火腿中ROAV 值较大的是壬醛、辛醛和芳樟醇，分别为316.76、293.25、248.29；发酵至150 d，火腿中ROAV 值较大的是3-甲基丁醛、己醛和庚醛，分别为689.76、100、22.26；发酵210 d，火腿中ROAV 值较大的是壬醛、辛醛、己醛，分别为184.26、145.76、100.00；发酵270 d、450 d、630 d，火腿中ROAV 值较大物质均为3-甲基丁醛、辛醛和壬醛，是大河乌猪火腿的特征性风味物质，3-甲基丁醛几乎是所以干腌火腿中的关键风味化合物，而辛醛和壬醛是金华火腿的主体风味成分，己醛则是如皋火腿的主体风味物质[41]，说明大河乌猪火腿的主体风味物质与金华火腿和如皋火腿有相似之处。

表3 火腿发酵过程中挥发性成分气味贡献表Table 3 Odor contribution of volatile components during ham fermentation

3 结论

标准化工艺条件下的大河乌猪火腿在发酵过程中共鉴定到137 种挥发性风味成分，包括醛、醇、酸、烃、酮、酯、芳香族类及其他类化合物。发酵210 d、270 d、450 d、630 d 的大河乌猪火腿中挥发性风味物质组成相似，说明210 d 的发酵期火腿的主体风味物质已基本形成，大河乌猪火腿的加工期可定为10～12个月；发酵过程中关键风味物质有1-庚醇、3-甲基-1-丁醇、3-甲基丁醛、桉树醇、2,3-辛二酮、2,4-癸二烯醛、苯乙醛、己醛、辛醛、壬醛、壬醛、(E)-2-壬烯醛、1-辛烯-3-醇、2-辛烯醛、芳樟醇、庚醛、2-戊基呋喃等16 种，其中对风味贡献较大的三种物质为3-甲基丁醛、辛醛和壬醛，是大河乌猪火腿的特征性风味物质。研究为大河乌猪火腿标准化加工技术提供理论依据。