一步法制备大豆不溶性肽-壳聚糖复合颗粒稳定的Pickering 双重乳液及其表征

舒欣怡，黄小楠，赖洋杰，李理，尹寿伟*

（1.华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州 510640）（2.中新国际联合研究院，广东广州 510555）（3.西南科技大学应用技术学院，四川绵阳 621000）

双重乳液是一种复杂的乳化体系，包括水包油包水型（W/O/W）和油包水包油型（O/W/O）[1]。在食品工业中，双重乳液被认为是能够减少乳液基食品的含油量[2]，同时不影响其自身口感的良好手段[3]；双重乳液具有分室结构，也可用于封装与保护易受光照、温度等环境影响的亲水性与疏水性生物活性物质，如营养素、风味物质、天然色素及益生菌[4-5]。双重乳液在化妆品、药品及材料领域也有较为广泛的应用[6-7]。传统的两步乳化法制备双重乳液程序复杂，主要通过表面活性剂、盐离子等提高乳液的稳定性。一步乳化制备双重乳液方法简单便捷，主要有微流控法、嵌段共聚物法及Pickering 乳液法。其中，Pickering 乳液利用胶体粒子不可逆吸附至油水界面形成的物理屏障，减少内相损失，改善双重乳液体系的稳定性，且相对其他制备方式中表面活性剂的使用更加经济、无毒、对环境友好。到目前为止，已经研究了由二氧化硅颗粒和氧化石墨烯颗粒等稳定的Pickering 双重乳液[8-10]。然而，由食品级胶体颗粒一步法制备双重乳液的研究鲜少报道。在单一高剪切/高压作用下，利用食品级胶体颗粒一步乳化法制备Pickering 双重乳液，将为工业生产带来新的研究思路和应用前景[11]。

大豆蛋白广泛应用于食品工业中，酶解制备的蛋白肽具有人体有益的保健功能，酶解过程形成的疏水肽团聚沉淀造成优质氨基酸资源浪费。张远红[12]研究了SPI 酶解过程中产生的不溶性聚集体，发现其具有与大豆蛋白相当的氨基酸均衡组分，且其自身具备优异的荷载能力，能够作为一种潜在的功能性食品配料。因此，利用大豆蛋白酶解副产物—水不溶性聚集体作为基料稳定Pickering 乳液能够进一步提高大豆蛋白酶解副产物的绿色可持续化应用。壳聚糖CS 是一种碱性阳离子多糖，由甲壳素通过碱性脱乙酰作用得到。其来源丰富，具有良好的生物相容性、生物可降解性、抑菌性等特点被广泛应用在各个领域。本研究将大豆蛋白酶解产生的水不溶性聚集体SWIA与壳聚糖CS通过静电相互作用制备结构稳定的复合胶体颗粒，通过一步法构建稳定的Pickering 双重乳液，系统研究了不同壳聚糖比、pH 值对Pickering 双重乳液的形成、稳定性、微观结构的影响，进一步探讨乳液微结构、流变特性与乳液稳定性之间的关系，为制备多重乳液提供一种简便有效的手段。

1 材料与方法

1.1 原料

SPI、玉米油，市购；低分子量壳聚糖，购于Sigma-Aldrich 公司；Protamex，购于诺维信酶制剂公司。

1.2 主要仪器设备

ALPHA1-4 冷冻干燥机，德国Christ 公司；T10高速剪切机，德国IKA 公司；Zeta 电位及纳米粒度仪Nano-ZS，英国Malvern 公司；MasterSizer3000 粒径分布仪，英国Malvern 公司；激光共聚焦显微镜，德国Leica 公司；HAKKE RS600 流变仪，德国Thermo公司。

1.3 试验方法

1.3.1 大豆水不溶性肽聚集体的制备

大豆水不溶性聚集体的制备参考张远红[12]报道的方法，稍加改动。以市售SPI 为原料，准确称取一定量的SPI 溶于去离子水中，配成4%（m/V）的SPI溶液，室温（25 ℃）下搅拌2 h。Protamex 的酶解条件：pH 7.0，温度50 ℃，加酶量1%（酶/底物，V/m）。蛋白和酶混合均匀后放入50 ℃恒温振荡器中水浴酶解24 h，酶解过程中用1 mol/L NaOH 维持pH 恒定。酶解后取酶解液在8000 ×g，25 ℃下离心20 min，取沉淀水洗3 次，冷冻干燥备用，所得粉末即为大豆水不溶性肽聚集体，记为SWIP。采用OPA 法测定水解度，参照Nielsen 等[13]的方法。本研究所制备SWIA是SPI 的水解度为12%时所得到，不溶性聚集体的得率为16.66%。

1.3.2 大豆水不溶性肽-壳聚糖复合胶体颗粒的制备

准确称取0.5 g 的SWIP 分散于100 mL 去离子水中，室温下磁力搅拌2 h 后于4 ℃下放置过夜使其充分水化，并用0.1 mol/L 的HCl 调节pH 至7.0，配置成0.5%（m/V）的分散液。将分散液在190 W（20%）超声处理，采用冰浴控制样品的温度在25 ℃以下。加入几滴0.02%叠氮钠后，大豆水不溶性肽聚集体分散液在4 ℃保存备用。称取不同质量的壳聚糖（CS）溶于1%的乙酸溶液中，搅拌过夜并离心去除少量不溶性物质，配置不同浓度的壳聚糖溶液（0.25%、0.5%、1%）。将壳聚糖溶液与超声处理的大豆水不溶性肽聚集体溶液等体积混合搅拌2 h，从而得到SWIP:CS 的质量比分别为2:1、1:1与1:2 的复合胶体颗粒，大豆水不溶性肽聚集体的最终浓度固定为0.25%。

1.3.3 大豆水不溶性肽-壳聚糖复合胶体颗粒的粒径和Zeta-电位的测定

采用Zetasizer Nano-ZS 测定胶体颗粒的粒径及分布、多分散系数（PDI）和Zeta-电势。测定在25 ℃进行，溶质为蛋白，其分散系数设置为1.45；分散相为水，其分散系数设置为1.330。每个样品至少测定三次，并取其平均值。

1.3.4 复合胶体颗粒的傅里叶红外（FT-IR）分析

将复合胶体颗粒溶液冻干获得待测样品粉末，取样品放置在玛瑙钵中，加入KBr 粉末（与待测样品质量比为1:100），均匀研磨后压片，进行波长扫描，扫描频率为500～4000 cm-1。

1.3.5 Pickering 双重乳液的制备

采用均质乳化技术制备Pickering 双重乳液。首先，制备两组大豆水不溶性肽聚集体溶液，一组中分为三份加入不同浓度的壳聚糖溶液，SWIP:CS 质量比分别为2:1、1:1与1:2，大豆水不溶性肽的终浓度固定为0.25%（m/V），考察不同壳聚糖比例对Pickering双重乳液形成及性能的影响。另外一组，加入壳聚糖溶液并固定SWIP:CS 质量比为1:1，测得其原始pH为3.8，缓慢滴加1 mol/L NaOH 溶液分布调整其pH为3.0、4.0、5.0 和6.0，研究在不同pH 值下Pickering双重乳液的形成与性能。其中，油相采用玉米油（占比50%），放置于血清瓶中，利用高速分散剂IKA T10进行均质（15000 r/min，2 min）得到Pickering 双重乳液。

1.3.6 Pickering 双重乳液的稳定性分析

观察乳析层随时间的变化来评价乳液的储藏稳定性。如果乳液的乳析层固定不变，也就意味着该乳液具备着良好的稳定性；但如果乳液的乳析层在不断的改变，而且在放置的时间内出现漏油破乳等现象，也就意味着乳液的稳定性不好。

1.3.7 Pickering 双重乳液的粒径分布测定

采用MasterSizer 3000 粒度分布仪测量乳状液的粒径。颗粒吸收率：0.001，颗粒折射率：1.470，分散剂折射率：1.330，分散剂是水。采用面积平均粒径d3,2及体积平均粒径d4,3来表示乳液粒径，设置样品测试三次。

1.3.8 Pickering 双重乳液的微观结构观察

采用光学显微镜观察Pickering 双重乳液的微观结构，将最新制备的乳液滴在载玻片上，盖上盖玻片调节适合的焦距进行观察。

利用激光共聚焦显微镜（CLSM）对乳液的分散状态进行观察。采用尼罗红染对油相染色，具体方法：用1,2-丙二醇溶解尼罗红（0.1%），取40 μL 混合染料加入到1 mL 乳液样品中，轻轻振荡，即完成染色。取少量染色的样品放置于载玻片凹槽并盖上盖玻片，用40 倍物镜观察。仪器参数设置如下：在488 nm 处激发，频率扫描的密度为1024×1024，频率为100 Hz。

1.3.9 Pickering 双重乳液的流变学特性

采用HAAKE RS600 流变仪器测定乳液的流变学特性。测试温度为25 ℃，使用直径27.83 mm 的平板，其间隙为1 mm。应力扫描：0.1 Pa 到1000 Pa，固定频率为1 Hz。频率扫描：0.1 Hz 到10 Hz，应力为1 Pa。粘度：在剪切速率为0.1 s-1到100 s-1记录粘度变化。

1.3.10 数据统计与分析

将每个实验所得的数据重复三次，实验结果以平均值±标准偏差的表示，并运用SPSS 25.0 软件进行显著性分析。

2 结果与讨论

2.1 大豆水不溶性肽-壳聚糖复合胶体颗粒构建及表征

2.1.1 复合胶体颗粒的粒径、电位及外观分析

在Zhang 等[14,15]的研究表明SPI 经酶解释放出来的疏水性氨基酸通过疏水相互作用形成了水不溶性的肽聚集体。本研究借助于高强度的超声，使得疏水肽之间、肽与蛋白之间的非共价键被打断，实现不溶性肽聚集体的解聚、分散，获得可分散性胶体粒子。如图1a 所示，在聚集体分散液底部有明显可见的沉淀物，经过超声处理之后，聚集体在水中的分散性有着显著的增强且分布均匀。在放置一段时间后，颗粒发生聚集产生沉淀析出。从表1 中能够看出，经过超声处理后的水分散胶体颗粒的粒径为124.60 nm，电位为14.60 mV，将其与壳聚糖进行复合后，新制备的复合胶体颗粒呈现出更为稳定均匀的胶体分散状态。如图1b 所示，复合颗粒的粒径介于229 nm 和501 nm之间，zeta 电位从14.60 mV 到49.50～54.7 mV，颗粒的放置稳定性增强，在储存过程中未见明显沉淀。因此，随着阳离子多糖壳聚糖的加入，复合胶体颗粒表面正电荷增强，在大豆不溶性肽聚集体颗粒粒子表面构筑多糖亲水层使疏水相互作用变弱而氢键增强，同时，壳聚糖链的空间位阻效应以及复合颗粒表面增强的静电斥力使得通过超声分散的聚集体粒子能够稳定的分散在水溶液中。

表1 不同壳聚糖比例颗粒的粒径和Zeta 电位值Table 1 Particle size and Zeta potential of complex particles

图1 a：超声处理解聚大豆不溶性肽团簇物；b：不同壳聚糖/肽比颗粒的外观图Fig.1 a:The stable SWIP dispersions by ultrasonic processing of aggregates;b:The appearance of chitosan/peptide complex particles

2.1.2 复合胶体颗粒的傅里叶红外分析

图2 是大豆不溶性肽聚集体、壳聚糖与SWIP：CS 质量比为1:1 的复合胶体颗粒的红外吸收光谱图（FT-IR）。从图中我们可以看出，大豆水不溶性肽在1680 cm-1处表现了强烈的伸缩振动峰，这是典型的蛋白质红外谱带—酰胺I 带，也就是C=O 伸缩振动，能够反映蛋白质的二级结构[16]。还有在1540 cm-1处的酰胺II 代（N-H 弯曲振动），以及处于1230-1350 cm-1区域内的酰胺III 带，大多数为C-N 键的伸缩振动[17,18]。除此之外，壳聚糖在3300 cm-1也出现了碳水化合物本身特有的伸缩振动峰-氢键，且其在1740 cm-1以及1660 cm-1也都出现了特征峰，分别是处于C=O键和COO-键的伸缩振动区域。与之相对应的，所形成的复合胶体颗粒（SWIP-CS）红外光谱中，壳聚糖的氢键特征峰轻微地向低波数移动，这也就表明胶体颗粒里分子间氢键的存在。

图2 复合胶体颗粒的FT-IR 图Fig.2 FTIR profiles of composite colloidal particles with CS and SWIP as the control

2.2 Pickering 双重乳液的制备

2.2.1 不同壳聚糖比例对Pickering 双重乳液粒径、稳定性及微观结构的影响

图3 Pickering 双重乳液外观Fig.3 Appearance of Pickering double emulsions

从图中可以看出，单纯由大豆不溶性聚集体制备的Pickering 乳液（a）很不稳定，在放置一个月后已全部破乳，这可能是疏水性驱动大豆不溶性聚集体颗粒聚结形成不溶性团簇体，影响胶体颗粒的界面吸附及界面覆盖率。因此，表面覆盖率低的分散油滴容易聚结，最终导致相分离。同时，由0.125%、0.25%与0.5%壳聚糖制备的乳液（e、f、g）在放置一个月后也出现明显的漏油现象，说明仅壳聚糖不能形成稳定的乳液。利用复合胶体颗粒新制备的乳液（b、c、d）均匀、细腻，呈乳白状，未乳析和分层。在放置了一个月后，随着壳聚糖比的增加，Pickering 乳液的乳析指数呈现不同的变化，但都维持在10%之内，大豆水不溶性肽/壳聚糖比例为1:1 的复合胶体颗粒制备的Pickering 乳液乳析指数最低，低于5%。大豆水不溶性肽-壳聚糖复合颗粒构建的Pickering 乳液有着稳固的界面层屏障，有效的防止液滴聚结。由此可见，通过复合胶体颗粒制备的Pickering 乳液具有更高的稳定性。

表2 是不同壳聚糖比例下的复合胶体颗粒（SWIP-CS）所稳定的Pickering 乳液粒径。Pickering乳液的粒径随着壳聚糖比例的增加呈现缓慢下降的趋势，结合双重乳液的外观图来看，不同比例下复合颗粒形成的乳液均较稳定，在粒度上的差异也并不显著。当大豆水不溶性肽-壳聚糖比例为1:2 时，乳液的粒径最小（23.9 μm），可能是此时颗粒上到油水界面的能力相对较强，具备更好的表面性能，从而能够形成更小尺度的乳液。

表2 不同壳聚糖浓度条件下的SWIP-CS 稳定的Pickering 双重乳液粒径Table 2 The size of Pickering double emulsions stabilized by SWIP-CS complex particles

图4 为不同壳聚糖浓度下复合胶体颗粒新制（a、c、e）与放置15 d（b、d、f）的Pickering 乳液的光学显微镜图。从中能够清晰地看到，不同壳聚糖比例的复合胶体颗粒都能够通过一步法制备出稳定的Pickering 双重乳液，在水包油乳液内部包含大量的油包水小乳滴，并且在放置半个月的时间后，内部的小乳滴数量并没有明显的减少，进一步证实了该Pickering 双重乳液具有优越的储藏稳定性。图5 是SWIP-CS 比例为2:1、1:1 时的复合胶体颗粒新制的Pickering 双重乳液激光共聚焦显微镜图，其中，使用尼罗红对玉米油进行染色。从图中能够清晰地看到，乳液液滴内部较多小液滴的存在，进一步证实了Pickering 双重乳液的形成。这可能是因为SPI 在进行酶解之后产生大量的疏水性氨基酸残基，其与壳聚糖进行复合之后使得形成的复合颗粒有着不同的表面润湿性分布，其中，一部分较为亲水，一部分较为疏水；其次，壳聚糖在连续相形成的三维网络结构，可以有效的防止内水相的聚结，并且，在Diam 等[19]的研究中发现，壳聚糖参与的两步乳化法制备双重乳液的过程中，其在内相与外相中的存在提高了W/O/W 双重乳液的物理稳定性。综合这些原因，才能够实现一步法得到稳定的Pickering 双重乳液。

图4 Pickering 双重乳液光学显微镜图（pH 3.8）Fig.4 Microscopy images of Pickering double emulsions by composite colloidal particles (pH 3.8)

图5 Pickering 双重乳液的激光共聚焦显图（pH3.8）Fig.5 CLSM images of Pickering double emulsions by composite particles (pH 3.8)

2.2.2 不同pH 值对Pickering 双重乳液粒径、稳定性及微观结构的影响

从图中可以明显的看出，新制的乳液较为均匀统一，在pH 从3.0 到5.0 之间，血清瓶中的乳液都没有出现漏油破乳的现象，但在pH 为6.0 的乳液表面出现稍微漏油的情况。在放置的过程中，乳液也开始出现乳析；不同pH 的乳液的乳析指数也有着一定程度的差异。在放置两天后，所有乳液的乳析指数逐渐稳定并保持不变。从图中乳液放置两个月的时间图中，能够看出随着pH 的增加，乳析指数也有着相应的上涨，但基本都维持在10%以内。

图6 不同pH 条件下的Pickering 双重乳液图Fig.6 Appearance of Pickering double emulsions at different pH conditions

表3 是不同pH 值的复合胶体颗粒（SWIP-CS）稳定的Pickering 双重乳液的粒径。由于上文中pH 6.0条件下制备的乳液不能够保持均匀统一的状态，容易破乳漏油，因此并没有对该pH 条件下所制备的乳液进行相应的研究。表中数据指出，随着pH 的增加，乳液的粒径并没有明显的改变。图7 为不同pH 条件下的复合胶体颗粒制备的Pickering 双重乳液光学显微镜图片，从图中能够清晰的看到，液滴内部全部都存在被包裹的小液滴，且在低pH 条件下，所稳定的乳液中液滴内部包含的小液滴数量最多，当pH 为5.0时，液滴内部包含小液滴数量有着显著的减少。由此可见，稳定Pickering 双重乳液的形成与复合胶体颗粒的pH 有着密切的关系，可以对其进行调控从而制备稳定的Pickering 双重乳液。

表3 不同pH 值下的SWIP-CS 稳定的Pickering 双重乳液粒径Table 3 Droplet size of Pickering double emulsions stabilized by composite particles (SWIP-CS) at different pH conditions

图7 Pickering 双重乳液光学显微镜图Fig.7 Microscopy images of Pickering double emulsions stabilized complex particles

2.3 Pickering 双重乳液的流变学特性

2.3.1 Pickering 双重乳液的频率、应力分析

通过小幅震荡测量，能够更为清楚地揭示微观结构与乳液流动性之间的关系[20]。图8a 是不同壳聚糖比例的复合胶体颗粒稳定的Pickering 双重乳液的应力扫描图，能够得出在线性粘弹区域内，不同壳聚糖比例的Pickering 双重乳液的储存模量（G＇）均明显要高于其损失模量（G″），这也就意味着该Pickering双重乳液具备类弹性固体的凝胶性质，是凝胶状乳液。随着应力的不断增加，储存模量（G＇）与损失模量（G″）相交于一点，也即是屈服点（临界应力），该点的出现也就意味着Pickering 双重乳液自身的结构发生了改变，从最初的凝胶状逐渐转化为溶胶状，这也是线性相应向非线性相应之间的转化。另外，随着壳聚糖比例的增加，双重乳液的起始G＇相对更大一些，其线性粘弹区域也较广，包括屈服点所出现的时间也逐渐变慢，表明其临界应力逐渐增大。在固定应力为1 Pa 的条件下，不同壳聚糖比例的Pickering 双重乳液随着频率的增加而逐渐增大，表明当壳聚糖比例较高时，双重乳液的凝胶特性也更强一些，这也与应力扫描的结果相一致。由此可见，通过控制复合胶体颗粒中壳聚糖的比例，能够对双重乳液的凝胶性质进行一定程度的改善。

图8 Pickering 双重乳液的应力、频率扫描图Fig.8 The stress and frequency scan of Pickering double emulsions

图8c、8d 是SWIP-CS 比例为1:1 时的复合胶体颗粒在pH 分别为3.0、3.8、4.0、5.0 下制备的Pickering双重乳液应力扫描与频率扫描图，从应力扫描图（c）中可知，不同pH 条件下所制备的Pickering 双重乳液都具备凝胶特性，其储存模量（G＇）明显要高于其损失模量（G″），同时在应力的不断增加下也出现了相应的屈服点。图中结果表明，随着pH 的增加，储存模量的起始点逐渐减小，其对应的屈服点也出现的越早，意味着临界压力也越少，由此可得出该Pickering双重乳液随着pH 的增加，其自身的凝胶性能以及稳定性都在降低。在频率扫描图（d）中也出现了同样的实验结果，不同的pH 条件下G＇都呈现出了较弱的频率依赖性，同时，随着pH 的上升，起始G＇逐渐减小，也就是说pH 能够影响双重乳液的凝胶特性，可以通过调控颗粒的pH 进而改善双重乳液的凝胶特性和稳定性。

2.3.2 Pickering 双重乳液的流动性分析

当评估双重乳液在食品中的应用时，粘度是个至关重要的参数，粘度也与乳液的稳定性密切相关。当剪切速率足够增加以克服布朗运动时，乳化液液滴沿着流场变得更加有序，并且提供较少的流动阻力，从而降低粘度。乳液的剪切稀化行为与油滴的絮凝有关，这种情况通常是乳液有着微弱絮凝或者是添加了增稠剂。絮凝增加了分散相体积，导致非球形聚集体的形成，这两个因素都有助于提高乳液的稠度[21]。

通过对乳液剪切稀化行为进行相应的研究，能够进一步探索该乳液的应用范围。从图9 中能够看出，当剪切速率在不断增加的时候，通过不同壳聚糖比例的复合胶体颗粒制备的W/O/W Pickering 双重乳液的表观粘度在逐渐减小，呈现出剪切稀化的现象，这也就进一步表明该乳液中絮凝结构的存在，属于牛顿流体的范畴。同时，随着壳聚糖比例的增加，所对应的W/O/W Pickering 双重乳液在表观粘度上也呈现逐渐增大的趋势，其流动性相应的减弱。结合上面的乳液微观结构图可得出，增大壳聚糖比例时乳液中水相粘度不断增加，同时能够防止内部液滴的聚结，从而能够对双重乳液的微观结构（即内水相与初级乳液滴的粒径）进行改善。

图9 不同壳聚糖浓度复合胶体颗粒制备的Pickering双重乳液的粘度图Fig.9 The viscosity of Pickering double emulsion prepared by complex colloidal particles with different chitosan concentrations

3 结论

本文将SPI 酶解产生的水不溶性聚集体进行超声处理，并与壳聚糖进行复合，制备得到的稳定分散的复合胶体颗粒，利用该复合胶体颗粒通过简单的一步均质法制备稳定的W/O/W 型Pickering 双重乳液，并研究了不同壳聚糖比例与pH 值对乳液性质的影响。结果表明，在pH 为3.0、3.8、4.0 和5.0 时，壳聚糖浓度为0.125%、0.25%和0.5%及油相分数为50%均能够制备稳定的Pickering 双重乳液，且具备较好的储藏稳定性与凝胶特性。此外，壳聚糖比例的增加使得乳液的粒径有着显著性的降低（30.6～23.9 μm），且较高比例（浓度为0.5%）时能够改善双重乳液的稳定性与凝胶特性。而随着pH 从3.0 增加到5.0，双重乳液液滴内部的小液滴数量逐渐减少，其稳定性与凝胶结构特性也在相应的降低。总的来说，通过调节复合胶体颗粒的pH与壳聚糖比例能够对双重乳液的稳定性与内部结构及凝胶特性进行相应的调控。本研究为制备双重乳液提供了一种简便有效的策略，对于食品工业、化妆品与医药领域上的应用具有重要意义。