粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇检测方法研究进展

戴煌，武旭悦，黄金发，毕洁，王加华，舒在习，肖安红*

（1.武汉轻工大学食品科学与工程学院，湖北武汉 430023）（2.大宗粮油精深加工教育部重点实验室，武汉轻工大学，湖北武汉 430023）（3.湖北省农产品加工与转化重点实验室，湖北武汉 430023）（4.山东新希望六和集团有限公司，山东青岛 266100）

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），化学名为3α,7α,15-三羟基草镰孢菌-9-烯-8-酮，分子式为C15H20O6，相对分子量为296.32，其化学结构式如图1 所示。DON 属单端孢霉烯族化合物，主要由禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、粉红镰刀菌、雪腐镰刀菌等镰刀菌产生[1]，其熔点为151～153 ℃，易溶于水、乙醇等溶剂，化学性质稳定，具有耐热、耐压、耐酸、耐储存等稳定性能[2]，在加工过程中很难被破坏，一直是粮食生产加工过程中的重要隐患。

图1 DON 化学结构式Fig.1 Chemical structure of DON

DON 具有细胞毒性和致癌性，易引起呕吐、不想进食、胃肠炎、腹泻、免疫抑制和血液病[3-6]，也称为呕吐毒素，被国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer，IARC）列为第3 类致癌物[7]。DON 广泛存在于食品和环境中，主要污染小麦、大麦、玉米等粮食作物，人和动物在误食被DON 污染的食物后会产生广泛的毒性效应。DON 常与其它的真菌毒素，如黄曲霉毒素，共同污染农作物，进入人体后可以相互影响[8]。国家和各省市市场监督管理局在2015～2020 年面粉的质量抽查数据显示，小麦粉不合格原因主要为真菌毒素超标，其中DON 含量超标最突出，占比高达76.60%[9]。DON 超标成为粮食，特别是小麦安全生产、消费和产业链发展的限制因素，对人类健康构成很大威胁，并引发巨大经济损失[10-11]。

DON 对粮食的严重污染引起了各国的高度重视，我国GB 2761-2017《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》、美国食品药品监督管理局（FDA）和联合国粮农组织（FAO）均规定DON 的最大限量值为1000 μg/kg；欧盟规定DON 的浓度不得超过750 μg/kg[11]。为保障食品安全、维护消费者权益，准确检测粮食中DON 含量对确定DON 污染程度至关重要。各国政府、企业、消费者以及相关专家迫切需要使用最经济、最有效的手段来提高粮食中DON 的可检测性。因此，为了有效降低DON 污染，保障食品安全，需要开发准确、快速的现场检测技术来监控粮食在种植、生产加工、流通等环节中的DON 污染水平。近年来，消费者对食品安全越来越关注，市场对现场快速检测技术需求也日益旺盛。随着检测技术的不断发展和进步，针对粮食中DON 的检测方法也越来越多[12-13]。2017 年国家食品药品监管总局组织制定了《食品快速检测方法评价技术规范》，为开发DON 快速检测方法提供了标准和依据。本文对常见的定性定量检测方法进行系统阐述，着重概述国内外DON 的快速检测方法，尤其是近年来发展的现场快速检测技术和方法，主要包括：薄层色谱法（thin layer chromatography，TLC）、液相色谱-质谱法（liquid chromatography-mass spectrography，LC-MS）、高效液相色谱-质谱法（high performance liquid chromatography-mass spectrography，HPLC-MS）、超高效液相色谱-质谱法（ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS）、酶联免疫法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、侧流免疫层析法（lateral flow immunoassay strips，LFIAs）、拉曼光谱法、电化学法、表面等离子共振法（surface plasmon resonance，SPR）等。通过对各种检测方法的基本原理、检测效果和应用价值进行对比，综述国内外研究情况，分析各方法存在的问题，指出现场快速检测发展方向，为开发出具有灵敏度高、准确度强、便捷式、快速检测的方法提供新思路，以期开发出满足粮食中DON 检测需求的新方法。

1 色谱法

1.1 薄层色谱法

薄层色谱法（thin layer chromatography，TLC）系将固定相涂布于玻璃板、塑料或铝基片上成均匀薄层。根据待点样展开后的比移值（Rf）与标准物色谱图的Rf相对比进行测定。该方法适用于粮食（小麦、玉米、大麦等）及其制品中DON的测定。DON在波长365 nm紫外光下显蓝色荧光，与标准品比较，计算其含量[14]。TLC 法的优点为所需设备简单、操作方便，检测成本低；缺点在于样品前处理复杂、操作繁琐、费时费力、测定时受周围环境影响，所得结果的准确性差、误差较大。该方法在基层粮食企业中的应用存在局限性，难适用于粮食及饲料中DON的快速筛查和精准检测，故此方法使用较少。

1.2 液相色谱法

高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）是以液体为流动相，采用高压输液系统，将具不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器（紫外检测器、质谱检测器等）进行检测，是DON 检测的国标采用方法。采用HPLC 法检测粮食中的DON 需要对样品进行前处理，去除基质干扰物，降低离子抑制，富集目标分析物来提高分析性能。传统HPLC 法对含DON的样品前处理一般采用液/液萃取法，目前研究人员尝试开发新型富集方法来提升检测性能，如Karami 等[15]使用Fe3O4磁性纳米粒子（magnetic nanoparticles，MNPs）对DON 进行富集，并采用HPLC-紫外检测法对其进行分析，该方法简便、快速、经济，检测限（limit of detection，LOD）低至45 μg/kg，可用于小麦样品中DON 的分析检测。罗颖鹏等人[16]使用固相萃取-高效液相色谱法对小麦中的DON 进行了测定，结果表明该检测方法的DON 回收率达到90.12%～106.25%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为4.51%。但该方法的提取、净化需要根据不同极性的真菌毒素采用不同的方法，操作复杂、时间长、成本高。未来需要结合DON 的性质，针对粮食基质复杂特点，开发高效、特异性强的萃取和净化材料，以提高HPLC 法的检测性能。

超高效液相色谱（UHPLC）克服了传统HPLC 分离能力差、分析速度慢的缺陷，UHPLC 使用更小粒径（＜2 μm）的包装材料来提高分辨率和灵敏度，以及支持更高压力（＞13000 bar）[17-18]。而串联质谱仪具备的高灵敏度、高选择性以及UHPLC 的高分辨率，所以UHPLC与质谱检测器的结合显示出明显的优势，使得在较短的分析时间内能同时分析多种真菌毒素，并达到较低的LOD 和定量限[17-18]。HPLC/UHPLC-MS/MS 检测灵敏度高，但该方法前处理操作繁琐、成本高、时间长、效率低，亟需开发适合我国粮食真菌毒素污染特点，便于在基层实验室推广的简便、快速、高效的检测方法。

2 免疫法

2.1 酶联免疫法

酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是把抗原-抗体的免疫反应和酶的高效催化作用有机结合起来的检测技术。简而言之，即为抗原被附着在微孔板上的特异性抗体捕获，形成抗原-抗体复合物，然后添加显色底物，底物被酶催化产生有色产物，如图2b 所示。此方法易于检测，提供了灵敏、可量化的比色信号，可用于推断靶标的存在与否及浓度的定量。由于所有的DON 都是半抗原，为了得到特异性好的抗体，需要将DON与蛋白质连接形成DON-蛋白复合物来制备抗体。在抗体浓度固定时，免疫法检测DON主要有直接竞争和间接竞争模式，如图2 所示。

图2 DON 的主要免疫测定模式：直接竞争（A）和间接竞争（B）Fig.2 Main immunoassay models:direct competitive (A) and indirect competitive (B)

目前对粮食中DON 的检测多数使用直接竞争酶联免疫法（competitive direct enzyme-linked immunosorbent assay，cd-ELISA），如图2A所示，和间接竞争酶联免疫法（competitive indirect enzyme-linked immunosorbent assay，ci-ELISA），如图2B 所示。cd-ELISA 具有稳定性好、特异性强、灵敏度高等优点，能充分评价基质效应，适合作为粮食中DON 残留检测的方法。Han 等[19]建立了cd-ELISA 检测食品和饲料 DON 的试剂盒，其线性范围为1.00～113.24 ng/mL，LOD 为0.62 ng/mL，半数最大抑制浓度（IC50）为 6.61 ng/mL，平均回收率为77.10%～107.00%，RSD 为4.20%～11.90%。该试剂盒具有特异性高、稳定性好、有效期长、样品基质干扰小等优点，适用于粮食中DON 的快速筛选。目前部分商业ELISA 试剂盒已在全球市场上得到优化和应用，但多数试剂盒在基质效应、有效样品预处理或对DON 高交叉反应性等方面评估有限，限制了其实际应用[20]。为了克服这一缺点，Zhang 等[21]研究开发了一种cd-ELISA 来检测DON，样品的检出限在0.15～0.48 mg/kg 之间，低于DON 在我国的最大残留限量标准。ci-ELISA 具有快速、半定量检测的优点，Li 等[22]建立了ci-ELISA 快速、灵敏测定粮食中的DON。该方法的IC50为61.10 ng/mL，LOD 为6.12 ng/mL，表明ci-ELISA 法测定粮食样品的可靠性。事实上，目前用于DON检测的ELISA试剂盒对3-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3-Acetyl-DON，3-AcDON）、15-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇（15-Acetyl-DON，15-AcDON）、葡萄糖苷化脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON-3-glucoside，DON-3-G）的交叉反应性高，当用准确的LC-MS/MS作为参考对天然污染粮食中的DON 进行分析时，ELISA 试剂盒的回收率通常超过100%，使DON 难以准确定量检测[23]。此外，由于粮食在加工过程中DON会转化成其衍生物形式（3-AcDON，15-AcDON 等），这些衍生物具有毒性，而以往的检测常常忽略这类衍生物，目前ELISA 法中未针对这类衍生物特异性地开发抗体来定量检测其含量[24-25]。当在不确定区域的法律限制范围使用时，ELISA 法容易造成DON 类毒素的低估，引起错误判断。因此，DON 商业化试剂盒应该通过监管机构进行严格检查，针对DON 及衍生物分别开发方法进行准确检测，综合评判DON 类毒素含量。

ELISA 灵敏度高、特异性强、成本低、设备简单，不需要专业的人员操作，可以用于实验室、企业、其他部门等的现场快速检测。目前，市场上已有许多商业化的ELISA 试剂盒[24,26]，其准确性、检测范围等方面都已较为成熟，可为现场快速筛查提供支持，特别是对满足发展中国家和不发达国家检测需求具有重要意义。但ELISA 法也存在不足之处，由于ELISA 是通过抗原和抗体的特异性结合进行检测，ELISA 的性能与抗体特异性强弱直接相关，DON 需要与牛血清蛋白等大分子蛋白质进行偶联后才会产生免疫原性，然而并不是所有的小分子物质都能够制造出相应的抗体。当前抗体制作繁琐、成本昂贵、稳定差，导致使用成本高。需要发展或合成具有高亲力的亲和新配体，特别是需要开发特异性强、稳定好、成本低的亲和配体，如适配体、重组抗体通过新突破来克服生物识别单元中特异性的限制，着眼于开发更灵敏的抗体/人工抗体，以及更廉价的抗体制备方法。

2.2 侧流免疫层析法

侧流免疫层析法（lateral flow immunoassay strips，LFIAs）是将特异抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品溶液后，由于毛细管虹吸作用，样品沿着硝酸纤维素膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金或免疫酶染色可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断，信号带可用肉眼定性和半定量估计，也可使用信号读取装置进行量化读取。为了保证抗体活性和有效性，在对照线上固定IgG 来捕获抗体-标记物，产生对照线信号带来确认，如图3 所示。

图3 侧流免疫层析试纸条结构和检测模式Fig.3 Structure and detection mode of lateral flow immunoassay strips

在大多数情况下，LFIAs 的敏感性通常低于ELISA[27]。为了提高LFIAs 的灵敏度，学者将目光集中于纳米材料的引入，与微粒和块状材料相比，纳米颗粒（nanoparticles，NPs）具有独特的热学、光学、磁性和化学性质，同时具有出色的表面效应、小尺寸效应和量子效应，容易实现较低的检测限、较短的检测时间和更高的灵敏度。常用于LFIAs 的NPs 包括纳米金（AuNPs）[28]、量子点（quantum dots，QDs）[29]、普鲁士蓝纳米颗粒（prussian blue nanoparticles，PBNPs）[30]、无定形纳米炭等。Yu 等[31]建立了一种快速、简便、低成本的LFIAs，同时检测DON、伏马毒素B1（fumonisin B1，FB1）和黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）。利用抗体修饰的AuNPs 作为信号标记物，建立竞争性抑制LFIAs 法，该法对DON、FB1和AFB1的LOD 分别为10.00 ng/mL、30.00 ng/mL 和10.00 ng/mL。为了更进一步提高灵敏度，Tian 等[30]用PBNPs代替AuNPs 作为标记物，用于信号产生和放大。通过免疫结合诱导的蓝色PBNPs 聚集产生信号，利用PBNPs 具有过氧化物模拟酶催化TMB 显色进行信号放大。在最佳条件下，PBNPs-LFIA 试纸条的动态检测范围为10.00 pg/mL～1.00 μg/mL，LOD 为10.00 pg/mL。该平台能够快速、灵敏、低成本地检测粮食中的DON，在传统基于AuNPs 作为标记物的基础上，灵敏度增加了近1000 倍。为了实现DON 的现场检测以及提高检测的效率，Liu 等[28]建立了基于智能手机的定量双重检测模式LFIAs 带，该设备集成了AuNPs和时间分辨荧光微球，可便捷、快速地测定粮食中多种真菌毒素，对DON 的LOD 为0.32 μg/kg，回收率在84.00%～110.00%。目前显色信号研究中AuNPs 研究最多，需要进一步开发新型信号标记物来提高检测灵敏度。

LFIAs 法通常用于低分子量化合物的测定，具有价格低廉、操作简便、快速便捷，能通过裸眼直接读出检测结果等优点，应用广泛。但存在敏感性不如其他免疫法的缺点。在对结果进行裸眼观察的情况下，由于无法准确记录颜色强度的变化，难以实现定量检测，导致损失了1～2 个数量级的灵敏度。随着先进制造技术的发展，特别是智能手机的普及，手机摄像头将为显色信号带成像以及分析研究带来便利，未来针对性开发相应的手机APP对LFIAs信号带的颜色强度进行快速分析和定性判别，对LFIAs 的现场实际使用有很大推动。同时，DON 抗体的结合并不完全依赖于抗体与DON 相互作用的能力[32]，结合环境和食品基质的干扰而导致假阳性结果，开发特异性强的抗体能有效降低假阳性率。

3 光谱法

3.1 拉曼光谱法

单色光照射在分子表面会发生散射，部分散射光与分子发生能量交换，光谱的波长会发生改变，这种光谱即为拉曼光谱[33]。光谱中尖锐的峰可用来表征物质的分子结构特性，可用于分析和鉴别相似物质，识别未知物质。常规拉曼散射截面分别只有红外和荧光过程的10-6和10-14，这种低灵敏度制约了拉曼光谱的应用[34]。为了增强拉曼信号，人们利用粗糙贵金属设计来进行表面增强拉曼光谱（surface enhancement raman spectroscopy，SERS），使其检测限提高了4～10个数量级，在物质快速检测和结构分析方面显示出巨大的潜力[35]。

为了提高检测的灵敏度、再现性和稳定性，学者开发了各种类型的纳米材料对拉曼光谱信号进行增强，如Tegegne 等[36]开发了聚多巴胺包裹银纳米立方核壳结构（AgNCs@PDA）对饲料中DON 进行定量检测。AgNCs@PDA 超薄PDA 壳层（1.60 nm）衬底通过氢键和π-π堆积作用增强了DON 的吸收，提高了衬底的稳定性，增强因子高达1.82×107，LOD 低至飞秒级（0.82 fmol/L）。Li 等[37]在涂有聚二甲基硅氧烷的阳极氧化铝表面溅射AuNPs，制备了花椰菜型3D-SERS 基底，三维纳米花椰菜SERS 基底可以实现玉米中AFB1、玉米赤霉烯酮（ZEN）和DON 的同时无标记检测，LOD 分别为1.80 ng/mL、47.70 ng/mL和24.80 ng/mL。该基底具有显著的SERS效应和活性，有望成为快速、无标记检测的SERS 基底。为了实现DON 的快速检测，Liu 等[38]使用双光子聚合法制备了200～600 nm 的纳米柱阵列作为SERS 基底，通过主成分分析法可对两种真菌毒素进行快速鉴别。SERS 基底的制作对信号增强程度至关重要，甚至直接决定SERS 法的最终检测性能。制作信号增强高、稳定、简便的基底是研究重点，随着柔性材料的发展，制作柔性SERS 基底来更好得贴合在被检测物体表面，更容易实现原位检测和实时监控，是当前研究热点。

3.2 近红外光谱法

近红外光谱（near infrared spectroscopy，NIRs）技术是通过获取待测物样本组成成分和分子结构的无损检测技术，具有高效、低成本以及多组分同时检测等优点，广泛应用于食品、制药、化工、农业等领域[39]。Peiris 等[40]利用傅里叶变换近红外光谱（FT-NIR）对小麦收获籽粒样品中DON 含量进行评价，在1000～2500 nm 光谱范围，对试验样品DON 含量的预测相关系数R2=0.62，预测均方根误差为8.01×10-6，对低/高 DON 含量小麦的分类准确率分别为60.80%～82.30%和82.30%～94.00%。FT-NIR 可以用于快速预筛选小麦污染情况。Liang 等[41]利用可见NIRs和短波NIRs 快速、无损检测受赤霉病感染加工而成的小麦粉，利用遗传算法筛选波长，并建立支持向量机判别模型，该方法对被DON 感染超标的小麦粉鉴别准确率达到96.00%。He 等[42]利用可见-NIRs 和计算机视觉技术模拟了正常小麦和受DON 污染小麦籽粒的在线识别系统，建立了基于光谱和纹理特征的线性判别分析模型，其识别准确率分别为95.06%和91.36%，可用于受DON 污染小麦的在线检测，具有很强实际应用价值。

光谱法具有灵敏、可靠、无损、实时的优点，不需要均质、萃取、使用染料或其他标记剂，也无需对样品进行预处理，检测范围广且检测过程无污染，能够真正地实现快速、无损检测。同时，结合计算机技术，光谱法可进行实时、实地在线监测和快速速筛查，极大地提高了分析效率，具有很强的实际应用价值。实际应用中需要注意的是，样本品种、产地、生长时间对光谱信号有干扰，并最终影响模型的准确度和检测限，需采集大量的样本光谱和实际测量值进行定标建模。随着大数据和人工智能技术的发展，建立粮食中DON 污染情况的指纹库，对粮食中的DON 含量进行智能化判别和预测，甚至对DON 污染和危害情况进行风险评估，是未来发展的方向。拉曼光谱仪器精密高、功能完备、价格昂贵，难以适应我国食品行业大规模检测的要求。因此，开发便携式拉曼光谱仪是拉曼技术在食品检测业应用的关键。

4 生物传感器方法

生物传感器是以生物活性单位（如酶、抗体、核酸、细胞等）作为生物敏感基元，对被测目标物具有高度选择性的检测器。通过各种物理、化学信号转换器（如氧电极、光敏管、场效应管、压电晶体等）捕捉目标物与敏感基元之间的反应，将反应程度用离散或连续的电信号表达出来，从而检测出被测物的浓度[43-44]。常用生物传感方法有电化学生物传感法和表面等离子共振法等。

4.1 电化学法

电化学分析法是根据溶液中物质的电化学性质及其变化规律，建立在以电位、电导、电流和电量等电学量与被测物质浓度之间计量关系的基础之上，对组分进行定性和定量的分析方法，其结构和检测模式如图4 所示。电化学分析法一般采用三电极系统，包含工作电极、对电极和参比电极。常用的信号检测方法有：循环伏安法（cyclic voltammetry，CV）、差分脉冲伏安法（differential pulse voltammetry，DPV）、方波伏安法（square wave voltammetry，AWV）、电化学阻抗谱法（electrochemical impedance spectroscopy，EIS）等。

图4 电化学法的结构和检测模式Fig.4 Structure and detection mode of electrochemical analysis

电化学法具有灵敏度高、操作简便、反应迅速等优点，在食品安全、疾病检测和环境监测等领域已经得到了广泛的应用。Valera 等[45]采用DON 生物功能化磁性粒子（DON-BSAMP）和CdSNP-DON 作为电化学纳米探针，建立电化学免疫传感器检测DON，CdSNPs 释放的镉离子在工作电极上被还原，并通过阳极AWV 法读取电信号，LOD 为342.40 μg/kg，低于欧盟规定的DON 最大残留限量。为了提高检测性能，一般在工作电极表面修饰功能材料，这些功能材料的修饰，提升了工作电极的电子传导效率，同时能提高抗原、抗体或适配体在界面的负载量，进而提高检测灵敏度。Lu 等[46]使用DPV 法对玉米中DON 进行快速、灵敏地检测，利用AuNPs-聚吡咯-还原氧化石墨烯纳米复合膜修饰工作电极，复合物能有效固定抗体，增强电导率和生物相容性。在最适条件下，该方法对DON 检测的线性范围为0.05～1.00 mg/L，LOD为8.60 μg/L。该传感器可在多种毒素共存环境中特异性检测DON，表现出高灵敏度和抗基质干扰性能。单一目标物检测方案限制了电化学法应用，需要开发多分析物传感器和阵列对DON 进行快速筛查。Wei 等[47]开发了3D 打印的“蜂窝”电化学生物传感器，开发的碳纳米纤维/明胶甲基丙烯酰基导电复合水凝胶具有良好加工性能，能很好印在8 通道丝网印刷碳电极上，使用EIS 法来评估DON、3-ADON 和15-ADON 的毒性，发现DON、3-AcDON 和15-AcDON 的浓度在0.10～10.00 μg/mL、0.05～100.00 μg/mL 和0.10～10.00 μg/mL 范围内时，对应的LOD 分别为0.07 μg/mL、0.10 μg/mL 和0.06 μg/mL，该方法可以评价真菌毒素的综合毒性，提高了检测效率。

与光谱法和色谱法相比，电化学法更便宜、简单、易于小型化，且具有成本低廉、灵敏度高、选择性强、响应速度快等优点，但电化学法存在基质干扰、稳定性差等缺点。近年来，比表面积大、生物相容性好、导电性好的纳米材料，如QDs、碳纳米管、石墨烯、MNPs、纳米聚合物等受到了广泛关注[48]。具有多孔结构的三维（3D）层次结构因其高的表面体积比，比传统的纳米晶体显示出独特的物理化学性质[49]。基于纳米材料的电化学免疫传感器在粮食检测中的应用也越来越受到人们的关注，为了验证电化学检测方法的可靠性，应对电化学法与纳米材料进行更深层的研究，充分探索电化学法的性能、使用范围和条件。随着微纳加工制造技术的发展，特别是微流控技术的发展和成熟，将清洗、富集、孵育、检测等操作步骤集成在一个平台上能有效提高检测效率，降低成本。

4.2 表面等离子共振法

当入射光以一定的入射角照射到金表面时，一部分光能穿过金层与金表面层中的电子耦合，电子由于激发在平行于金属表面方向上移动，发生表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR），物质附着在金属表面时会导致SPR 频率变化，即SPR 共振角变化[50]，如图5a 所示。当DON与SPR 传感器芯片上抗体或者适配体结合时，会引起金属表面质量浓度的变化，产生明显的SPR 信号响应，如图5b 所示。

图5 （a）SPR 原理图和（b）抗体修饰SPR 芯片直接检测DON的传感图Fig.5 (a) the schematic diagram and (b) senorgram for the direct SPR detection of DON using antibody coated chip

SPR 技术具有高选择性、高灵敏度、高通量、实时监测和低样品消耗等优点，在检测方面发挥着重要的作用。Choi 等[51]利用分子印迹（molecular imprinting，MIP）技术与SPR 传感器相结合来检测DON。在模板分子DON 存在下，将吡咯电聚合到裸Au-SPR 芯片上制备了聚合物，分子印迹聚吡咯（MIPPy）-SPR 传感器对 DON 的检测范围为0.10～100.00 ng/mL，检测限＞1.00 ng/mL。该方法对DON、3-AcDON 和15-AcDON 的选择性效率分别为100.00%、19.00%和44.00%，选择性强。SPR 法可同时检测粮食中多种真菌毒素，如Wei 等[52]建立了利用SPR 技术同时检测玉米和小麦中AFB1、赭曲霉毒素A、ZEN 和DON，其LOD 分别为0.59 ng/mL、7.07 ng/mL、1.27 ng/mL 和3.26 ng/mL，四种真菌毒素的交叉反应性均较低，与HPLC-MS/MS 分析结果具有很好的一致性。SPR 方法具有灵敏度高、实时、免标记的优点，但是SPR 法也存在设备体积大、价格昂贵、消费者较难承受的问题，限制了该方法的实际应用。目前SPR 法在理论研究中不足，需要进一步探索，同时对应的设备应往小型化、便捷化方向发展。

5 结论与展望

DON 是小麦中检出率最高、危害最严重的真菌毒素之一，已成为关系粮食安全和食品安全的重要问题。开发准确、快速的现场检测方法对实时了解DON的污染情况，针对性地对其进行防控，以及对确保粮食和食品安全具有重要意义。在本文综述的方法中，TCL 法操作简便，但样品前处理复杂、易受周围环境影响，结果准确性差、灵敏度低，难以广泛使用。传统的LC/LC-MS/HPLC/HPLC-MS 检测方法结果准确、灵敏度高、重复性好，是国标中采用的方法，但需要专业性强的技术人员和高昂精密的仪器，样本的前处理繁琐，不适合于现场、快速检测。随着现代科学技术的不断发展，快速、简便、特异、灵敏、低耗的DON 检测方法是未来发展的方向。其中ELISA 和LFIAs 法操作简便、成本低，结果可以通过肉眼直接观察，可用于现场快速检测和筛查，具有很强的实际应用潜力，但其灵敏度不高，难以实现定量检测。光谱法可以实现快速、简单、可重复、无损伤的定性定量分析，无需前处理，可用于DON 的在线快速筛查，具有很强的应用潜力，但存在需要建立大量样本模型，SERS 基底制作稳定性差的不足。电化学分析法成本低廉、灵敏度高、体积小，已被证明是很有实际应用价值的检测方法。以上介绍的传统和新型检测方法各有优势，需要结合实际情况选取合适的检测方法。未来主要发展方向有：（1）在免疫法检测中，需要发展或合成具有高亲力的亲和新配体，特别是需要开发特异性强、稳定好、成本低的亲和配体，通过新突破来克服生物识别单元中特异性的限制来提高检测灵敏度，避免严重的基质干扰。利用生物技术开发更灵敏的纳米抗体和人工抗体，以及更廉价的抗体制备方法。（2）在ELISA 法和电化学法中，酶活性是影响检测性能的关键因素，可以通过改善酶的热稳定性或者开发新材料/酶增加热稳定性。最近研究表明，部分纳米材料具有类似酶的特性和良好的热稳定性，可用于构建新型传感器[53]。还可以将酶固定在纳米材料内部/表面，以提高酶催化环境的稳定性。（3）在电化学方法中，开发新型简便的修饰方法将酶/抗体固定在纳米材料上，降低电子转移电阻、纳米材料对酶/抗体活性影响，来提高电极的稳定性、灵敏度、选择性和使用寿命。（4）需要开发高效的分离、富集技术对样本进行前处理，缩短样品处理时间，同时避免基质效应和非特异性吸附等问题。（5）随着便携式拉曼光谱仪的开发，相关标准图库的建立，拉曼成像技术的提高以及新型的拉曼技术（如紫外拉曼和时间分辨拉曼等）的应用，拉曼技术将会在DON检测有广泛的应用前景。由于粮食成分复杂，环境中的污染无法彻底消除，目前DON 的检测方法难以在粮食安全指标测试中便捷使用，需要进一步研究。我们相信DON 检测技术将在未来得到更多的发展，来满足灵敏度、简便性、智能性和便携性的需求。