双氢青蒿素在多种疾病治疗中的作用及机制研究进展*

邓小丽, 任媛, 杨振, 袁兵

云南省第一人民医院(昆明理工大学附属医院)呼吸与危重症医学科(云南昆明 650032)

青蒿素是一种具有过氧桥的倍半萜内酯类活性化合物，是从菊科植物黄花蒿中提取出来的一种化合物，主要衍生物有双氢青蒿素(DHA)、蒿甲醚、青蒿琥酯等，其中DHA是青蒿素经四氢硼钠还原而成的半合成衍生物，其在体外的抗疟活性甚至超过青蒿素本身，不溶于水，易溶于有机溶剂，具有代谢和排泄迅速、体内分布广泛、毒性低等生物利用特点。DHA早期的研究主要集中于其抗疟疾作用，但在临床应用过程中发现除抗疟疾作用外，DHA在抗肿瘤、抗寄生虫、抗微生物、抗纤维化及自身免疫性疾病等多种疾病治疗中也具有重要作用，本文将从以下几方面综述DHA在临床疾病治疗中的作用及可能的作用机制。

1 抗疟疾作用

疟疾是一种广泛流行于热带和亚热带地区，具有较高的发病率和病死率的虫媒传染病，给人类健康带来严重威胁，据世界卫生组织发布的《2019世界疟疾报告》中指出，2018年全球2.28亿疟疾患者中约40.5万人死亡，治疗疟疾任重而道远。DHA在内的青蒿素及其衍生物作为治疗疟疾的一线药物得到广泛应用，可用于各类疟疾的治疗特别是恶性疟疾，对疟原虫红内期有强大且快速的杀灭作用，能迅速控制临床发作及症状[1]，且在一定程度上可提高患者机体免疫功能。有关青蒿素及其衍生物的抗疟作用机制，目前多认为是寄生于体内的疟原虫可通过自身合成或通过摄入宿主红细胞的血红蛋白，分解成血红素。而亚铁血红素能够激活青蒿素，催化青蒿素类物质的过氧桥键的裂解，产生大量以青蒿素碳原子为中心的活性氧自由基，而疟原虫对自由基非常敏感，通过烷基化、过氧化膜脂质、干扰线粒体功能、与疟原虫的蛋白质作用等途径导致疟原虫的死亡。与铁死亡诱导剂处理类似，DHA以浓度依赖性方式显著增强滋养体阶段恶性疟原虫细胞内亚铁和膜脂质过氧化物水平，成为诱导恶性疟原虫死亡的一种重要方式[2]。在临床应用青蒿素抗疟疾过程中，不断出现耐青蒿素的恶性疟原虫，为应对青蒿素耐药这一问题，科学家们在1978年利用硼氢化钠将青蒿素还原成DHA，并在以后的新药开发研究中以DHA为母核，在保留过氧键的基础上，引入一些亲水、亲脂基团进行结构修饰，合成出大量的青蒿素衍生物，遗憾的是，合成的这些青蒿素衍生物中大多数衍生物的抗疟疾活性并不强，仅DHA、蒿甲醚、蒿乙醚和青蒿琥酯等不多的青蒿素衍生物具有较强的抗疟疾作用，比如合成的双氢青蒿素衍生物二聚体(DHA二聚体)在体内和体外的抗疟疾作用均大于DHA，抗疟疾作用随着药物浓度的增加而增加[3]。

2 抗肿瘤作用

在临床应用青蒿素及衍生物的过程中发现，DHA除传统抗疟疾作用外，在乳腺癌、肺癌、肝癌、结直肠癌、黑色素瘤、卵巢癌、胶质瘤、胰腺癌等多种肿瘤中均表现出良好的抗肿瘤细胞活性。而DHA比青蒿琥酯、蒿甲醚等青蒿素衍生物更有效，其抗癌机制可能通过调节与细胞生长信号、凋亡、增殖、血管生成、组织侵袭和转移等相关的基因和蛋白质，经不同信号途径相互作用，最终导致肿瘤细胞生长抑制或死亡[4]。DHA在不同肿瘤中的抗肿瘤效应包括以下方面。

2.1 与铁离子相关的抗肿瘤效应 包括：(1)氧化应激反应：肿瘤细胞易受活性氧自由基(ROS)损伤，一些抗肿瘤药物即通过产生高氧化应激反应发挥其抗肿瘤特性，研究显示肿瘤细胞应用DHA后，细胞内的二价铁可激活并催化DHA分子内过氧化物桥裂解，产生大量高度烷基化的以碳为中心的自由基和活性氧，产生的活性氧等活性中间体可损伤肿瘤细胞DNA，在一项探讨DHA对人宫颈癌HeLa细胞逆转作用的研究发现，DHA促进ROS生成，诱导DNA双链断裂损伤，增加Bcl-2在ser70磷酸化水平，触发HeLa细胞自噬[5]，促氧化剂双氧水能加强DHA的杀瘤作用，而抗氧化剂维生素E会减弱DHA的杀瘤作用[6]，而氧自由基清除剂N-叔丁基-α-苯基硝酮(PBN)能减弱DHA的抑瘤活性[7]；(2)破坏细胞内铁离子平衡：DHA能够作用于膜铁转运蛋白(fransferrin receptor 1, TFR1)、Ferroportin 1(FP1)等铁代谢分子，抑制TFR1介导的Fe3+细胞内流，干预FP1介导的Fe2+外流，破坏癌细胞内铁离子平衡，导致细胞内缺乏Fe2+，干预肿瘤细胞增殖[8]，而当采用去铁胺螯合铁离子后，DHA的杀瘤作用明显减弱[7]；(3)铁死亡：青蒿素类药物破坏细胞内铁平衡，还可激发铁离子介导的细胞毒作用，引发“铁死亡(ferroptosis)”，抑制肿瘤细胞生长[9]。

2.2 抑制肿瘤增殖 DHA可以通过破坏细胞周期动力学或干扰增殖相互作用途径来阻断肿瘤细胞的生长，这种生长停滞的机制多种多样，根据肿瘤细胞的组织来源和表型不同，细胞周期调节机制也不同。DHA和吉非替尼联用可显著下调非小细胞肺癌(NSCLC)(NCI-H1975)细胞的G2/M调节蛋白[包括细胞周期蛋白B1(cyclin B1)和细胞周期蛋白依赖性激酶1(Cdk1)]的蛋白表达水平，抑制Cdk1-cyclinB1复合物的形成，而Cdk1-cyclinB1复合体对一些生物体有丝分裂的启动至关重要，导致G2/M期细胞周期停滞，抑制细胞增殖[10]。而对于NSCLC细胞(A549和H1299)，DHA可下调细胞周期蛋白D(cyclin D)，导致G1期细胞周期阻滞[11]，但也有研究显示DHA可抑制A549细胞增殖，导致S期细胞周期阻滞。

2.3 促细胞凋亡 凋亡一般是由促凋亡基因Bax和抗凋亡Bcl-2家族基因之间平衡介导的过程，DHA是青蒿素衍生物中最有效的活性成分，诱导细胞凋亡所用的有效剂量仅为青蒿素剂量的十分之一，暴露12 h后即可诱导细胞凋亡，根据细胞系的不同，DHA在20～50 mmol/L浓度范围内有效，而青蒿素最大作用所需的浓度范围为200～300 mmol/L[12]，DHA通过调节Bax/Bcl-2比值诱导细胞凋亡[4]。DHA也可通过下调肺癌SPC-A-1细胞survivin的mRNA和蛋白表达水平，诱导细胞凋亡[13]。除凋亡相关蛋白外，钙离子也在DHA诱导肺癌细胞系(SPC-A-1细胞、PC-14细胞)凋亡信号通路中起重要作用[14]。

2.4 抑制血管生成 肿瘤血管生成是肿瘤恶性转化的标志，抑制新生血管，可以减少肿瘤细胞氧气和营养供应，从而阻止肿瘤的生长，DHA处理能显著降低肝癌细胞血管生成基因ANGPTL2表达[15]。在胰腺癌DHA则通过抑制核因子-κB(NF-κB)的DNA结合活性，从而显著降低血管内皮生长因子、白细胞介素-8(IL-8)、环氧合酶-2(COX-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)等NF-κB靶向原血管生成基因产物的表达[16]。而在有关肺癌的研究显示DHA和顺铂联合治疗对肿瘤血管生成同样有协同作用，DHA可通过降低肺癌细胞缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达，减少血管生成，降低血管密度[17]。

2.5 抗侵袭和迁移 远处转移是恶性细胞通过细胞外基质侵入和扩散的过程，与肿瘤的高病死率和高复发率有关，基质金属蛋白酶(MMP)、钙黏蛋白E(E-cadherin)以及编码细胞外基质处理蛋白酶、运动因子和黏附蛋白等的基因在肿瘤转移中起重要作用[4]，DHA以剂量依赖的方式抑制MMP活性，降低细胞侵袭活性；抑制了癌症干细胞标记物(包括nanog、sox2和oct3/4)以及上皮间质转化(EMT)相关蛋白(如N-钙黏蛋白和波形蛋白)的表达，影响肿瘤的转移[11]。DHA在不同肿瘤中的抗肿瘤效应见表1。

表1 DHA在不同肿瘤中的抗肿瘤效应及机制

3 抗寄生虫作用

世界卫生组织估计，全球有超过15亿人感染了由土壤传播的寄生虫，而食源性人寄生虫病每年会在全球范围内造成200万的致残和死亡，对人类健康和家畜生产危害十分严重。随着研究的深入，青蒿素及其衍生物已广泛用于治疗疟疾和其他原生动物感染，认为可能是治疗各种具有公共卫生意义的蠕虫疾病的有效药物。国内学者李洪军等[40]对青蒿素衍生物之一的DHA在抗寄生虫疾病中的作用有过较为全面的介绍，文献系统阐述了DHA对血吸虫、弓形虫、杜氏利什曼原虫和蓝氏贾第鞭毛虫等多种寄生虫均有显著效果，但其杀虫机制尚待阐明。目前有关DHA抗寄生虫治疗的研究包括：蠕虫治疗方面，血吸虫病是由血吸虫属血吸虫感染引起的一种热带、亚热带地区的主要寄生虫病，曾对我国人民的身体健康造成严重危害，近年来对吡喹酮耐药血吸虫的出现对我国血吸虫病的防治重新构成重大威胁。值得高兴的是自20世纪80年代初以来，青蒿素及其衍生物已被发现对血吸虫(尤其是幼虫寄生虫)有效，并在之后临床实践中，对中国预防和治疗人类血吸虫病中发挥了关键作用，其中DHA对日本血吸虫和曼氏血吸虫有很高的活性[41]，给予受血吸虫感染的小鼠、兔子和狗一定剂量的DHA治疗后，能明显减少体内的血吸虫体数量。在小鼠体内证实DHA对7 d血吸虫和35 d成熟血吸虫有较高的活性，口服DHA后能有效减少血吸虫数量[42]。其抗血吸虫病机制为通过减少蠕虫(尤其是雌性)和存活蠕虫的产卵，抑制组织受困虫卵周围肉芽肿的形成，减轻了寄生虫感染宿主的损害[43]。针对棘球绦虫感染，DHA对多房棘球绦虫和细粒棘球绦虫幼虫期的体外治疗显示出良好的效果，而对感染多房棘球绦虫的小鼠[200 mg/(kg·d)]的体内治疗6周没有效果，但与单独使用阿苯达唑相比，DHA联合使用阿苯达唑可显著降低寄生虫虫体重量[44]。三苯达唑是治疗多种吸虫病的首选药，但也存在药物耐药的问题，因此有学者也尝试应用青蒿素及衍生物进行治疗，有学者使用DHA等青蒿素衍生物治疗肝片形吸虫发现，给予感染吸虫大鼠口服10 μg/mL浓度的DHA 72 h后可致1/4的吸虫死亡，剩余虫体表面粗糙，活动性减少，而给予100 μg/mL浓度的DHA 72 h可杀灭所有吸虫。对于其他寄生虫病，比如在抗弓形虫作用方面国内外也有报道，有研究显示体外实验，用0.1～0.5 μg/mL的DHA在96 h内可抑制70%的寄生虫生长，小鼠体内实验中采用青蒿琥酯和DHA联合治疗仅5 d可减少约40%的脑囊肿，对小鼠体内弓形虫具有良好的抑制作用，同时对弓形虫引起的肝损伤有一定的缓解作用[45]。其作用机制可能与DHA可改变虫体超微结构，如速殖子细胞核核周间隙扩张、染色质边集、核固缩, 细胞膜泡状突起、膜系统广泛破坏, 细胞质溶解、形成大量形状多样的不规则空泡，导致虫体崩解有关。

4 抗自身免疫性疾病

DHA可能对免疫缺陷患者的免疫反应起到平衡作用，有研究显示DHA在体外能有效抑制Th细胞的分化，减少自身免疫性脑脊髓炎的发病，并进一步在小鼠实验中证实DHA通过调节mTOR途径减轻自身免疫性脑脊髓炎临床症状[46]。干燥综合征、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮等结缔组织自身免疫性疾病在治疗方面主要依赖糖皮质激素和免疫抑制剂，但由于上述药物的不良反应较多，且对部分疾病治疗效果有限而需要寻找新的替代药物，越来越多的证据表明青蒿素及其衍生物具有很强的抗炎和免疫调节作用。系统性红斑狼疮(SLE)是一种以多器官损伤为特征的慢性自身免疫性炎症性疾病，受到另一个抗疟药氯喹治疗自身免疫性疾病的启发，屠呦呦团队将DHA用于系统性红斑狼疮的治疗并获得成功，据团队前期临床观察，青蒿素对盘状红斑狼疮、系统性红斑狼疮的治疗有效率分别超90%、80%。动物实验研究发现DHA改善BXSB小鼠狼疮症状的机制为：DHA可通过NF-κB途径抑制肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等细胞因子的产生。其他研究则提示DHA能改善原发性狼疮症状的机制可能为：DHA通过减轻髓系源性抑制细胞(MDSC)参与Nrf2/HO-1途径诱导的衰老，减轻SLE的症状[47]，或通过抑制MRL/lpr小鼠脾细胞TLR4/IRF/IFN途径抑制LPS诱导的细胞活化，对SLE具有潜在的治疗作用[48]。DHA对其他自身免疫性疾病也有治疗作用，如DHA的衍生物DC32能明显减轻胶原诱导关节炎的DBA/1小鼠足垫炎症反应，降低软骨降解。其机制可能为：DC32通过Nrf2-p62-keap1反馈环，通过增加Nrf2的mRNA和蛋白水平，诱导p62表达，从而显著抑制类风湿关节炎[49]。或通过下调白细胞介素-6(IL-6)的表达和转录，恢复Treg/Th17平衡，抑制淋巴细胞浸润，从而减轻类风湿性关节炎[50]。炎症性肠病是一种特发性炎症性疾病，其特征是自身免疫性疾病，包括T辅助性(Th)/T调节细胞(Treg)平衡功能障碍。有研究者采用恶唑酮和2,4,6-三硝基苯磺酸诱导建立结肠炎小鼠模型，使用DHA治疗可改善模型小鼠的结肠炎症状，减少淋巴细胞浸润和组织纤维化，其机制可能与DHA分别降低了2,4,6-三硝基苯磺酸和恶唑酮诱导的结肠炎中Th1和Th17细胞以及Th9和Th22细胞的数量，并增加了两种模型中的T调节细胞；抑制活化的CD4+T淋巴细胞，诱导细胞凋亡；以及促进了血红素氧合酶-1 (HO-1)在体内外的产生等免疫调节有关[51]。

5 抗微生物作用

病原微生物是人类感染性疾病的重要致病病原体。近年来随着耐药菌的不断出现，抗感染药物选择压力逐渐增大，寻找或开发新的抗感染药物已成为人类研究的一个方向。研究显示青蒿素及其衍生物也具有一定的抗菌作用，但其抗菌作用均较弱，且对于不同的革兰阳性菌、革兰阴性菌，青蒿素及其衍生物具有不同的抗菌活性，如DHA对大肠杆菌的抗菌活性比青蒿琥酯和青蒿素强，但对金黄色葡萄球菌没有明显抗菌活性。随着结核病疫情在许多国家死灰复燃、卷土重来，以及耐药结核病患者数量持续上升，Kalani等[52]利用DHA进行化学转化，研发新的抗结核药物发现，DHA及其衍生物抗结核潜力，DHA-1D可杀死小鼠骨髓巨噬细胞感染模型中62%的细胞内结核分枝杆菌。幽门螺杆菌感染可诱发慢性胃炎，与胃癌发病的密切相关。Sisto等[53]首次体外实验验证青蒿素及衍生物(包括DHA)具有抗细胞内幽门螺旋杆菌活性的作用，特别是与抗生素联合使用时能明显增强其抗菌效果，表明青蒿素及衍生物有治疗幽门螺旋杆菌感染的潜力。进一步有学者研究证实，青蒿素及其衍生物青蒿琥酯和DHA能抑制幽门螺杆菌和胃癌细胞的生长，抑制幽门螺杆菌与胃癌细胞的黏附，增强ROS的产生而减少幽门螺杆菌[54]。DHA还具有抗真菌作用，DHA作用于烟草链格孢菌后，一方面破坏细胞膜完整度，胞内核酸不断流失，另一方面抑制麦角甾醇的合成，阻碍真菌细胞的新陈代谢，破坏真菌孢子[55]。在一些体外研究中报道了青蒿素及其衍生物(包括DHA)具有抗病毒特性，DHA对寨卡病毒的复制有部分抑制作用[56]。而合成的DHA三唑衍生物则具有一定的抗HIV病毒作用。

6 抗纤维化作用

肺纤维化是正常在肺泡组织被破坏后经过异常修复导致结构异常、瘢痕形成的一类疾病，对人类健康危害极大。研究显示，DHA能有效降低大鼠肺组织转化生长因子-β1(TGF-β1)和Smad 2/3蛋白表达水平，对摄入矽尘或博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化有抑制作用[57]。DHA也可通过显著降低博莱霉素诱导的肺纤维化患者的氧化应激和胶原合成水平，抑制Ⅱ型肺泡上皮细胞分化，减轻肺损伤和纤维化[58]。DHA除可减轻肺纤维化外，对其他器官的纤维化的改善也有作用，如DHA可以通过抑制PI3K/AKT途径调节成纤维细胞增殖和分化来减轻肾纤维化，可作为治疗肾纤维化的药物[59]。在一项有关肝纤维化的研究中发现，DHA可通过ROS-JNK1/2途径，介导DHA诱导自噬，增加了活化肝星状细胞的自噬体生成和自噬通量，抑制大鼠肝纤维化模型活化肝星状细胞促炎细胞因子的表达和炎症反应，对抗肝纤维化在内的疾病[60]。也有研究显示DHA可降低了α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、α1(Ⅰ)胶原和纤维连接蛋白的表达，可能通过PDGF-βR/ERK途径靶向活化肝星状细胞来减轻肝纤维化[61]。

7 讨论

DHA作为活性较强的青蒿素类衍生物，首先广泛应用于抗疟疾方面，但在药物临床应用过程中发现DHA的药理作用并不仅仅局限于疟疾的治疗，在肿瘤性疾病的治疗中也获得较多的应用和研究。DHA可通过多种肿瘤相关的信号转导通路(如Wnt/-catenin通路、p38MAPK、JAK2/STAT3、NF-κB、MYC/MAX、AP-1、CREBP、mTOR等)，对肿瘤细胞产生包括氧化应激反应产生活性氧，DNA损伤和修复，各种细胞死亡模式(包括细胞凋亡、自噬、铁坏死等)，细胞周期阻滞，抑制血管生成，抗侵袭和迁移等作用方式抑制肿瘤细胞生长或促进其死亡。针对寄生虫病的发病控制多以吡喹酮、阿苯达唑等化疗药物为主，药物严重的不良反应和毒性，以及药物诱导耐药性也是疾病治疗的一个难题，目前研究显示包括DHA在内的青蒿素及其衍生物可老药新用，对蠕虫等寄生虫病有较好的治疗效果，应用前景值得期待。此外，DHA也具备一定的抗菌、抗自身免疫性疾病、抗纤维化等治疗作用，但研究成果不多，对于其是否能作为现有治疗药物的替代药物尚需进一步研究。更为关键的是，虽然DHA对多种疾病具有一定的治疗作用或治疗潜力，但对其作用机制研究尚不充分，相信随着DHA药物作用机制研究的不断探索和深入，可以较为详细地了解DHA临床适应证，阐明该药物在各疾病治疗中的药理学和药效学。青蒿素及其衍生物(包括DHA)，作为最早被确认为抗疟药的旧药物，将继续创造新的故事。