流式细胞检测技术在不孕症中的应用*

苗竹林, 宋革, 崔蓉, 钟兴明, 姜荣华, 刘宇, 邓华倩

广东省生殖医院、广东省生殖科学研究所、国家卫生和计划生育委员会男性生殖与遗传重点实验室(广东广州 510600)

流式细胞技术(flow cytometry，FCM)是20世纪 70 年代快速发展起来的一门高新检测技术，运用激光技术结合分子生物学及细胞免疫学等知识，通过对细胞表面特征及细胞内因子进行分析，并在分子水平上对细胞进行快速定性和定量研究，同时对单细胞或其他生物粒子进行功能分析并分选的一种检测手段[1]。激光流式细胞检测技术在儿科、免疫科、血液科、肿瘤科等临床多个学科应用广泛，是疾病诊治及预后评估的重要辅助检查手段[2]。但是，在妇产科尤其在生殖医学领域的应用价值还不明确。生殖面临的主要问题是不孕与流产，近年来不孕不育患者逐年增加，不孕症患者尤其是不明原因的不孕症及自然流产目前认为与免疫因素有关[3]，是否可以通过流式细胞检测不孕症患者淋巴细胞亚群变化？早期、快速评估患者免疫功能尚存在争议，且临床应用价值不确定，需要进一步探讨。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2015年2月至2020年6月期间，广东省生殖医院因不孕或自然流产就诊的女性患者，年龄20～44岁。经患者同意行流式细胞检验。FACScalibur流式细胞仪(美国Becton Dickinson，BD公司)，溶血素(FACS lysing solution)、CD45 PerCP、 CD56 FITC、CD3APC、CD19 FITC、CD16PE、CD5 APC、CD4 FITC，CD8PE鼠抗人荧光抗体购自美国BD公司。检测项目包括：T淋巴细胞及其亚群：CD3+T、CD4-CD8+/CD3+、CD4+CD8-/CD3+、CD4+/CD8+T细胞；自然杀伤细胞(natural killer cell,NK细胞)及其亚群：CD3-CD56+、CD3+CD56+NKT、CD56dimCD16+、CD56brightCD16-NK细胞；B淋巴细胞及其亚群：CD19+B，CD5+CD19+B细胞。实验过程严格按试剂说明书进行，首先在流式上样管做好标记，每个管中加入对应检验抗体20 μL，之后加入50 μL外周血，混匀，室温(20～25℃)避光孵育15 min。加入450 μL 1X FACS lysing solution 轻轻混匀，室温(20～25℃)避光孵育15 min，加入2 mL PBS，混匀，1 200 r/min离心5 min，去上清液。300 μL PBS 重悬，统一在流式细胞仪上机检测。

1.2 判断标准 依据本实验室建立的正常参考值范围结合文献报道，淋巴细胞参考值范围：NK细胞为8.1%～18.0%，T淋巴细胞61.1%～77.0%，B淋巴细胞7.3%～18.2%，高于或者低于正常参考值范围均属于异常。

1.3 统计学方法 使用SPSS 13.0统计软件，计数资料以频数 (百分率) 表示。使用Cell Quest软件计算CD3+T淋巴细胞，CD19+B淋巴细胞，CD3-CD56+NK细胞亚群比例。

2 结果

2.1 不孕症患者流式细胞检测淋巴细胞及细胞亚群检测结果 首先结合物理参数和特异性的荧光标志进行分群，之后进行分类，进一步确定比例关系。通过对CD45+细胞进行设门，得到稳定的总的淋巴细胞，进一步对亚群进行分析，CD3+T淋巴细胞及其CD4+CD8-T细胞和CD4-CD8+T细胞亚群及百分比流式散点图，见图1，CD19+B淋巴细胞及CD5+CD19+B细胞，CD5-CD19+B细胞亚群分析过程流式散点图，见图2。CD56+NK细胞及其CD3+CD56+NKT细胞，CD56dimCD16+细胞CD56brightCD16-NK细胞亚群流式散点图，见图3。

注：选择SSC/CD45+淋巴细胞(lymphocyte)作为分析对象， CD3+/LYMT淋巴细胞进行设门,Q1：CD4-CD8+T细胞占CD3+T细胞比例 32.1%； Q3：CD4+CD8-T细胞占CD3+T细胞比例62.7%

注：选择SSC/CD45+淋巴细胞作为分析对象，圈出CD19+/LYM为B淋巴细胞进一步分析,Q2:CD5+CD19+B细胞比例6.19%

注：选择SSC/CD45+淋巴细胞作为分析对象，圈出CD3-CD56+/LYM为NK细胞进一步分析,Q1:CD3-CD56+NK细胞占淋巴细胞比例25.1%; Q2:CD3+CD56+NKT比例3.55%，CD56dimCD16+比例87.4%，CD56brightCD16-NK细胞比例1.02%

2.2 不孕症患者淋巴细胞检测结果分析 不孕症患者共检测分析外周血T淋巴细胞及其亚群1 959例，其中1 380例在正常范围，占总检测例数的70.44%，异常例数579例，占总检测例数的29.56%；其中增高人数占59.41%(344/579)，降低占40.59%(235/579)。检测分析外周血B淋巴细胞及其亚群3 118例；其中2 542例在正常范围，占总检测例数的81.53%，异常例数576例，占总检测例数的18.47%，异常例数中增高人数占63.72%(367/576)，降低占36.28%(209/576)。NK细胞及其亚群2260例，其中1153例在正常范围，占总检测例数的51.02%，异常例数1 107例，占总检测例数的48.98%；其中增高人数占77.33%(856/1 107)，降低占22.67%(251/110 7)，见表1。

表1 不孕症患者淋巴细胞检测及结果分析 例(%)

3 讨论

不孕症是目前危害女性生殖健康的主要原因，据报道我国育龄妇女中不孕症发病率约 10%～15%，且有逐年增加趋势[4]。不孕症包括不能妊娠和妊娠后自然流产两个方面的问题。

不孕症不是独立的疾病，它是由多种疾病以及多种原因引起的生殖功能障碍。包括不容易受孕与妊娠后胚胎停止发育，正常妊娠是一个复杂的生理过程，女性必需具备正常的卵泡发育及排卵；正常的子宫内环境及发育正常且通畅输卵管；男方必需有发育正常而且能够排出的精子；任何一个环节出现问题都将导致不孕症的发生[5]。进一步剖析引起这些问题的原因，有利于针对性的进行治疗。

在临床实践过程中，不同于其他学科，例如儿科、血液科及肿瘤科，患者表现有明确的临床症状提示血液及免疫系统功能的异常，之后经过进一步检测明确诊断。而育龄期女性的特点是多数发热、疼痛等临床表现不明显，有些甚至仅仅表现为不孕或者妊娠后胚胎停止发育等自然流产现象。因此，除了一些遗传、内分泌及解剖学因素等明确的病因之外，对一些不明原因的不孕及流产患者是否需要评估免疫功能，如何来评估等问题一直是一个难题。

随着生殖免疫学的快速发展，免疫因素导致的不孕及自然流产受到人们的重视，人体健康状况是否能够耐受妊娠带来的变化，需要进行检测。

淋巴细胞的水平是机体细胞免疫和体液免疫功能的重要指标，作为临床应用指标，需要动态检测，因此，选择高效，快速，稳定性及重复性好，精密度高的检测仪器，更能敏感地反映患者免疫功能的变化[6]。

近年来，流式细胞检测技术发展迅速，经荧光染色的细胞受激光激发后所产生的荧光信号通过光电转换器转变成电信号，从而进行细胞表面抗原分析，细胞分类和亚群分析[7]。目前，流式细胞检测技术日臻完善，在临床上的应用日益成熟，动态评估及快速检测成为可能[8]。流式细胞检测技术对于人体细胞免疫功能的评估以及各种血液病及肿瘤的诊断、治疗以及预后的评估有重要指导价值[2,9]。而在妇产科临床工作中目前临床应用并不广泛，应用价值也不确定，对这项技术的利用还十分有限。

本课题采用流式细胞技术，主要检测的淋巴细胞包括T淋巴细胞、B 淋巴细胞及 NK 细胞，这3种细胞是人体内重要的免疫活性细胞，具有多种生物学功能，对机体细胞免疫应答起到重要的调节作用[10]。检测过程表明可操作性强，分群清晰，检测结果稳定。

通过分析不孕症患者外周血淋巴细胞占比变化，结果表明T、B和NK三种淋巴细胞都有不同程度的异常，表现为超过或低于正常参考范围，提示不孕症患者存在一定比例的免疫功能紊乱，值得引起患者及医务工作者的重视。免疫力下降可以引发多种妇科疾病，同时一些内外科及妇科疾病也引起免疫力的异常，是导致年轻女性生殖功能下降的主要原因之一，需要结合原发病变进行分析。

流式细胞检测技术可以通过进一步分析各个淋巴细胞及其亚群变化来精细分析并评估患者的免疫功能，例如CD3+T细胞可进一步检测CD4+细胞及 CD8+T细胞亚群数量及比值的变化[11]；CD19+B淋巴细胞进一步分化为CD19+CD5+B和CD19+CD5-B细胞；NK细胞进一步分为CD3+CD56+NKT细胞，CD56dimCD16+NK细胞，CD56brightCD16-NK细胞[12]。

流式细胞术通过淋巴细胞及其亚群的变化检测为机体免疫系统的变化评估提供了帮助。本结果提示，应用流式细胞检测技术可以快速得出外周血淋巴细胞及其亚群状态，动态研究淋巴细胞的变化趋势，有利于揭示疾病发生的本质，进一步指导临床实践，为不孕症等妇科疾病的高效、精准化防治提供理论依据[13]。

本研究正常值范围参照本医院以及文献报道的成人参考值范围[14]，目前国内外育龄期女性外周血淋巴细胞亚群参考值范围尚未见报道，值得进一步研究。