血清miR-PC-5P-12969、miR-422b、miR-221-3p在急性缺血性脑卒中的表达及意义*

王亚倩，杨 鑫，高 杨，刘 超

河北省石家庄市第三医院检验科,河北石家庄 050011

脑卒中后患者病死率和致残率较高，80%以上的脑卒中为急性缺血性脑卒中(AIS)[1]。CT和MRI是诊断AIS患者的主要方法，也是鉴别AIS与出血性脑卒中(HS)的主要手段。CT虽可准确鉴别诊断AIS和HS，但对于早期AIS，特别是6 h以内的AIS诊断较困难；MRI对发病6 h以内的病灶诊断最灵敏，但其价格较昂贵且MRI不应用于急诊，因此，其诊断早期脑卒中较困难[2]。AIS最有效的治疗手段是重组人组织型纤溶酶原激活剂(rtPA)溶栓治疗，但其治疗时间窗较狭窄，从而限制其临床应用。因此，对于AIS的早期预测和预后评估，需要寻找有效的生物标志物。小分子核糖核酸(miRNA)是一组由20～24个核苷酸构成的非编码、内源性单链RNA分子，通过调节基因表达在多种生理和病理过程中扮演重要角色，主要包括细胞增殖、代谢、免疫、炎性反应、肿瘤发生等[3]。此外，miRNA可能与神经发育及功能有关，与靶基因共同参与炎性反应、神经血管再生、脑水肿形成等与AIS相关的病理、生理过程。目前，有研究表明，miRNA可以在血浆、血清、尿液和脑脊液等多种体液中检测到，且非常稳定，这表明其有可能作为诊断或监测治疗各种疾病的生物标志物，包括AIS[4]，提示miRNA可能是AIS患者早期预测的分子标志物和有效的治疗靶标。在具有差异性表达的miRNA谱中，miR-PC-5P-12969、miR-422b、miR-221-3p在发生AIS时表达最明显[5-6]，但3项指标与AIS疾病严重程度的关系有待进一步研究。因此，本研究旨在探讨不同严重程度的AIS患者血清miR-PC-5P-12969、miR-422b、miR-221-3p表达水平及其临床意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2017年1月至2020年1月本院收治的141例初诊为AIS的患者作为研究组，其中：男64例，女77例；年龄51～84岁，平均(69.34±6.52)岁。纳入标准：符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018》[7]诊断标准；急性起病(24 h内)；临床体征有局部或全身神经功能障碍；经CT灌注成像 (CTP)或磁共振成像(MRI)+扩散加权成像(DWI)检查明确病灶。排除标准：复发性脑梗死；经计算机体层血管成像(CTA)等检查确定为非血管性病变；头颅CT或MRI检查诊断为HS；严重心、肾功能障碍；合并恶性肿瘤及血液系统疾病；患精神疾病或存在意识障碍不能配合完成本研究。按照美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分，将AIS患者分为轻度组、中度组、重度组。轻度组46例，NIHSS<5分，男19例、女27例，年龄51～79岁、平均(62.28±6.52)岁；中度组51例，5分≤NIHSS≤20分，男22例、女29例，年龄55～80岁、平均(68.05±6.52)岁；重度组44例，NIHSS>20分，男23例、女21例，年龄58～84岁、平均(71.64±6.52)岁。另外收集50例同期来本院脑血管门诊就诊，并最终经各种检查确诊仅为一般性心脑血管疾病，无梗死病灶，无局部或全身神经功能障碍的普通患者作为对照组，男23例、女27例，年龄54～82岁、平均(68.61±6.52)岁。收集并记录所有研究对象的基线资料，包括性别、年龄、空腹血糖、三酰甘油、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高血压、糖尿病、高脂血症、体质量指数、吸烟史、饮酒史及短暂性脑缺血发作(TIA)病史，研究组与对照组上述资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。本研究经本院医学伦理委员会批准，所有患者家属均签署知情同意书。

表1 研究组与对照组基线资料比较[n/n或或n(%)]

组别n高血压糖尿病高脂血症体质量指数(kg/m2)吸烟史饮酒史TIA病史研究组14182(58.16)69(48.94)27(19.15)22.65±2.3474(52.48)41(29.08)23(16.31)对照组5031(62.00)18(36.00)14(28.00)22.91±1.8625(50.00)13(26.00)8(16.00)χ2/t0.2262.491.7151.3040.0910.1720.003P0.6350.1150.190 0.2560.7630.6780.959

1.2血清miR-PC-5P-12969、miR-422b、miR-221-3p检测 所有研究对象均于入院当天抽取静脉血5 mL，置于未加入抗凝剂的真空采血管中，室温下进行离心操作，离心后吸取上层血清并加入提取剂(TRIzol)，于-80 ℃保存以备使用。按照试剂盒(安捷伦科技有限公司，加利福尼亚州，美国)说明书提取血清中总RNA，用去除基因组反转录试剂盒(上海西唐生物科技有限公司)将待测标本反转录为cDNA。反转录体系为10 μL∶2 μL mix，≤5 00 ng RNA，加入无RNA酶水至反应溶液体积10.0 mL。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测血清miR-PC-5P-12969、miR-422b、miR-221-3p表达水平，采用miRNA荧光定量检测试剂盒及75200荧光定量扩增仪(北京博凌科为生物科技有限公司)检测。PCR反应条件：95 ℃预变性2 min，再进行95 ℃变性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸25 s，40个循环。PCR总反应体系为20.0 μL：以SnoR-202为内参，特定正向引物1.0 μL，常用反向引物1.0 μL，2× SYBRVR Green PCR 10.0 μL，cDNA 1.0 μL，最后加入无RNA酶水至反应溶液20.0 μL。引物购自北京博凌科为生物科技有限公司。采用2-ΔΔCt法计算相对表达结果。实验重复3次。

2 结 果

2.1各组3种血清miRNA的表达水平 轻度组、中度组、重度组AIS患者血清miR-PC-5P-12969、miR-422b、miR-221-3p表达水平均明显低于对照组，且3项指标表达水平均随AIS疾病的严重程度增加呈降低趋势，两两比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组3种血清miRNA的表达水平

2.2多因素Logistic回归分析发生AIS的危险因素 采用逐步后退多因素Logistic回归分析，结果显示，血清miR-PC-5P-12969、miR-422b和miR-221-3p水平降低是发生AIS的独立危险因素(P<0.05)。见表3。

表3 多因素Logistic回归分析发生AIS的危险因素

2.3ROC曲线分析3种血清miRNA诊断AIS的效能 ROC曲线分析结果显示，血清miR-PC-5P-12969、miR-422b、miR-221-3p诊断AIS的AUC分别为0.815、0.756、0.771，且具有较高的特异度和灵敏度。见表4和图1。

表4 3种血清miRNA诊断AIS的效能

图1 3种血清miRNA诊断AIS的ROC曲线

3 讨 论

AIS是脑缺血后发生的一系列病理事件，最终可导致不可逆性神经损伤，是中老年人最常见的心脑血管疾病之一。临床症状主要为脑缺血坏死区域对应的神经功能缺损，诊断主要依靠询问病史、查体和影像学检查，部分患者早期影像学检查未见异常表现，部分影像学检查表现不典型，而溶栓治疗时间窗在6 h以内。血液标本是最易获得的检测标本，血清中存在稳定的miRNA，在冠心病、肿瘤等疾病中可呈特征性表达谱[8]，目前，尚缺乏可靠的血液生物标志物预测AIS。因此，探索血清生物标志物miRNA用于AIS的诊断、预测病情变化的临床价值具有重要意义。

miRNA参与转录后调控，是多种疾病的潜在生物标志物，如肿瘤、阿尔茨海默病和AIS[9]。有研究表明，miRNA是诊断AIS或判断预后的潜在标志物[10]。另有研究表明，miRNA在AIS中扮演着重要角色，如参与动脉粥样硬化、炎性反应、神经血管再生、细胞凋亡、脑水肿形成等[11]。特异性miRNA的异常表达通过改变靶基因表达调节缺血后神经的死亡[7]。有研究表明，miR-PC-5P-12969通过抑制颅内血管miRNA的翻译，使淀粉样蛋白表达减少，诱发AIS；脑血管动脉粥样硬化的斑块脱落、血管堵塞，发生脑卒中，导致脑组织中miR-PC-5P-12969表达上调，但外周血中的miR-PC-5P-12969表达降低[12]。细胞实验显示，在AIS诱导的HT22细胞中miR-PC-5P-12969表达水平升高了两倍。动物实验显示，小鼠大脑皮层的miR-PC-5P-12969水平在AIS后4 h和1 d内明显升高，且正常脑组织中miR-PC-5P-12969表达在观察时间内呈低表达,且表达量没有明显改变[12]。VIJAYAN 等[5]的研究表明，miR-PC-5P-12969仅在缺血状态下才表达，可作为AIS特异性生物标志物。

miR-422b最初在HL-60白血病细胞中被发现，通过调控细胞PGC1β蛋白表达调节细胞与机体的氧化代谢[12]。笔者推测在AIS患者中，因脑组织缺血缺氧，导致氧化代谢水平降低，从而使PGC1β蛋白表达减少，进一步导致血清miR-422b表达水平降低。miR-221前体的3′端加工即为miR-221-3p。miR-221-3p在血管平滑肌细胞和血管内皮细胞中呈高表达[13]。血管损伤、血管平滑肌细胞的增殖和新生内膜的生长导致血管平滑肌细胞中miR-221-3p表达上调[14]，在动脉粥样硬化患者的血管内皮细胞中miR-221-3p表达上调[15]。AIS主要表现为颈部和颅内动脉血管粥样硬化、血管损伤，血管中miR-221-3p表达上调，导致血清中miR-221-3p表达降低。WANG等[6]研究显示，AIS患者血清miR-221-3p和miR-382-5p水平明显低于健康对照者。本研究结果显示，3组AIS患者3种血清miRNA表达均明显低于对照组，随着神经功能缺损的加重，AIS的3种miRNA表达呈明显的降低趋势(P<0.05)。表明AIS患者血清miRNA表达降低，且神经功能缺损越严重的患者，血清miRNA水平越低，因此，3种血清miRNA可能是诊断AIS发生及判断AIS病情严重程度的潜在指标。

本研究多因素Logistic回归分析发现，血清miR-PC-5P-12969、miR-422b和miR-221-3p水平降低是发生AIS的独立危险因素。ROC曲线分析显示，血清miR-PC-5P-12969、miR-422b和miR-221-3p水平对AIS的诊断具有较高的特异度和灵敏度，与以往研究结论一致[5-6]。

本研究存在的主要问题：样本相对较少，只是一个研究中心的结果；没有做3种miRNA与AIS疗效、预后的相关性探讨；3种miRNA定量平台无标准化处理流程，特别是引物序列、内参及试剂比例与操作方案的标准化，检测结果的重复性与可靠性有待商榷。因此，未来的研究需先建立标准化的检测方法，然后在可获得稳定检测结果的情况下，调查健康人群的参考范围，再研究指标与疾病发生发展、治疗效果和预后的关系，使检测结果可在临床中使用。

综上所述，血清miR-PC-5P-12969、miR-422b和miR-221-3p在AIS患者中表达降低，其表达水平随着AIS疾病严重程度增加而呈降低趋势，3项指标降低均为发生AIS的独立危险因素，是早期诊断AIS、判断AIS严重程度的潜在血清学标志物。