晚期非小细胞肺癌患者肿瘤组织、血液、胸腔积液EGFR基因突变一致性研究＊

高山，高岩，杨俊省，田涛

（枣庄市立医院肿瘤科，山东 枣庄 277100）

肺癌是我国目前发病率和死亡率最高的肿瘤[1]，其中非小细胞肺癌占80%～85%，大部分患者检出时已为晚期[2]。近年来，非小细胞肺癌的传统化疗未见突破性进展，且副反应严重。2000 年，表皮因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs）—吉非替尼（Gefitinib）首次被批准应用于临床治疗，并获得很好的疗效[3]。EGFR 是NSCLC 患者接受酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）如易瑞沙、伊瑞可等靶向药物治疗的重要生物标记物，我国卫生部门要求NSCLC 患者在接受靶向药物治疗之前必须进行EGFR 检测。组织活检是癌症诊断的金标准，但组织活检存在操作风险较高、组织样本获得困难、无法实时监测等缺点。而血液、胸腔积液EGFR 检测是一种方便、快捷、新兴的非侵入性检测方法。本研究收集2019 年1 月—2020 年10 月我院送检的非小细胞肺癌患者肿瘤组织、血液、胸腔积液标本，检测非小细胞肺癌患者肿瘤组织、血液及胸腔积液中EGFR 第19 和21 外显子的突变状态，初步探讨组织EGFR 与血液、胸腔积液阳性检出率的关系，以期指导晚期非小细胞肺癌患者临床用药，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集2019 年1 月—2020 年10 月确诊为NSCLC患者并行EGFR 基因检测的病例269 例，另收集同期进行肿瘤组织、血液、胸腔积液EGFR 检测的NSCLC患者54 例，EGFR-TKI 耐药后同时行血液及胸腔积液T790M 检测的患者23 例。纳入标准：①组织学证实为非小细胞肺癌的患者；②胸腔积液患者均通过CT 或者彩超诊断有胸腔积液且能够穿刺引流出积液；③确保所获得的标本能满足检测需要；④患者组织病理分型参考20115 版世界卫生组织（WHO）的肺癌组织学分类，根据第8 版国际肺癌研究协会（IASLC）的肺癌TNM分期进行入选标本的临床分期；⑤患者及家属知情同意，并签署知情同意书；⑥该研究经医学伦理委员会批准。

1.2 标本采集

①组织标本采集：收集来自我院经皮肺穿刺、电子支气管镜的活检组织，用4%中性缓冲的甲醛进行标本的固定。②细胞标本采集：收集我院胸腔积液患者，进行胸腔穿刺置管引流术，将首次引流出的液体样品以1 500 rpm 离心5 min，离心半径13.5 cm，并吸取约30 ml 透明上清液直接送检。③血液标本采集：常温下采集全血后轻摇混匀，离心，分离出血浆。使用含有游离DNA 保护剂及防细胞裂解保护剂的采血管。

1.3 方法

①液体标本游离核酸提取步骤：取样：将液体样本充分振荡混匀，然后将样本取2 ml 加入到一个单独的 15 ml试管中；加裂解液：样本中加入250 μl 的PK+2 ml 的DNA PBB，混匀；裂解样本：室温下（15～30 ℃）孵育30 min；DNA 吸附至膜上：加入500 μl 异丙醇，混匀后移入HPEA FT 中，离心；清洗膜1：500 μl 的WB Ⅰ工作液加入到FT 中，离心；清洗膜2：500 μl的WB Ⅱ工作液加入到FT 中，离心；清洗膜3：500 μl的WB Ⅱ工作液加入到FT 中，离心；干燥过滤膜：16 000×g 离心1 min；洗脱液孵育：100 μl DNA EB 加入到FT 滤膜的中心，室温下孵育FT 及洗脱管5 min；洗脱DNA：8 000×g 离心FT 及洗脱1 min；收集洗脱液于洗脱管中，混匀后的DNA 储备溶液可用于PCR 检测。②组织标DNA 提取：样本脱蜡：将组织在二甲苯浸泡组织5 min，再无水乙醇容器中浸泡5 min；取样：从玻片中刮下组织放入1.5 ml 离心管；加裂解液：样品管中加入DNA TLB 和PK；裂解样本：56 ℃干浴加热器中孵育60 min；去交联：90 ℃干浴加热器中孵育60 min；DNA 吸附至膜上：加入200 μl DNA 结合缓冲液（DNA PBB）+100 μl 异丙醇，混匀，离心；清洗膜1：500 μl 的WB Ⅰ工作液加入到FT 中，离心；清洗膜2：500 μl 的WB Ⅱ工作液加入到FT 中，离心；清洗膜3：500 μl 的WB Ⅱ工作液加入到FT 中，离心；干燥过滤膜：16 000×g 离心1 min；洗脱液孵育：100 μl DNA EB 加入到FT 滤膜的中心，室温下孵育FT及洗脱管5 min；洗脱DNA：8 000×g 离心FT 及洗脱1 min。③荧光PCR 法检测EGFR 的操作步骤：RNA质量检测：采用紫外吸收法测定RNA 溶液浓度和纯度；样品cDNA 合成；按照变性、退火、延伸进行循环。

1.4 统计方法

采用SPSS 19.0 软件进行统计分析，计数资料以[n（%）] 表示， 采用χ2检验， 以P＜0.05 为差异有统计学意义。不同标本基因突变的用Kappa 检验（Kappa＞0.77 为一致性好，0.4～0.77 为一致性良好，＜0.4 为一致性差）。

2 结果

2.1 EGFR 基因突变与NSCLC 患者性别、病理类型的关系

NSCLC 肿瘤组织标本中EGFR 突变率为47.58%（128/269），其中女性突变率高于男性，腺癌突变率高于鳞癌，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 EGFR 突变与非小细胞肺癌临床、病理类型关系（n，%）

2.2 肿瘤组织、血液、胸腔积液中EGFR 基因突变检测

在NSCLC 患者并行EGFR 基因检测的病例269 例中，肿瘤组织中EGFR 突变率为为47.58%（128/269），其中19 外显子突变占32.03（41/128），低于21 外显子L858R 突变的62.50%（80/128）。血液标本中EGFR突变率为36.90%（31/84），其中19 外显子突变占32.25%（10/31），低于L858R 突变的64.51%（20/31）；胸腔积液标本中EGFR 突变率41.54%（27/65），其中19 外显子突变占29.63%（8/27），低于L858R 突变的66.67%（18/27），差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 组织、血液、胸腔积液标本中主要突变类型比较（n，%）

2.3 NSCLC 患者中同时检测组织、血液、胸腔积液中EGFR 突变率比较

54 例同时检测组织、血液、胸腔积液患者中组织检测突变型26 例，突变率48.14%（26/54）；血液检测突变型21 例，突变率38.89%（21/54）；胸腔积液检测突变型22 例，突变率40.74%（22/54）；54 例患者中血液突变率为38.89%，与对应的肿瘤组织突变率的48.14%相比，对EGFR 突变的检出具有较好的一致性（Kappa=0.72）。胸水突变率为40.74%，与对应的肿瘤组织突变率的48.14%相比，对EGFR 突变的检出具有极好的一致性（Kappa=0.84）。

2.4 NSCLC 血液中T790M 突变检测

23 例EGFR-TKI 治疗耐药患者的胸水和血液样本中，胸水中检出15 例T790M 基因突变，突变率为65.22%（15/23）；血液中检出11 例T790M 突变，突变率为52.17%（11/23）；胸水T790M 突变率略高于血液突变率，但差异无统计学意义（χ2=1.415，P＞0.05）。

3 讨论

3.1 血液、胸腔积液与对应的肿瘤组织EGFR 突变的一致性

液体活检技术（血清、胸腹腔积液等）作为一种新兴的检测方法，由于其非侵入性、方便、快捷和较高的可靠性等优点已越来越多地被应用于临床，其中的信息为肿瘤患者的个性化医疗提供有力的依据[4]。研究表明[5]，组织DNA 和循环DNA 一致性较好；且美国胸科医师学会循证临床实践指南指出[6]，胸水细胞学诊断敏感性平均为63%。Liu X 等[7]研究发现，胸水细胞与组织样本的一致率为81%。本研究结果显示，血液与对应的肿瘤组织相比，对EGFR 突变的检出具有较好的一致性（Kappa=0.62）；胸水与对应的肿瘤组织相比，对EGFR 突变的检出具有极好的一致性（Kappa=0.84），因本实验纳入的患者同时检测肿瘤组织、血液、胸腔积液，所以更具对比性、可靠性。这样对于一些老年患者、失去组织活检机会的患者，仍可以通过血液、胸腔积液检测EGFR 突变状态。

3.2 EGFR 基因突变与NSCLC 患者性别、病理类型的关系

本研究结果显示，女性EGFR 突变率高于男性，腺癌EGFR 突变率高于鳞癌（P＜0.05）。无论在肿瘤组织、血液还是胸腔积液，21 外显子L858R 突变率高于19 外显子突变（P＜0.05）。Zhang YX 等[8]研究显示，EGFR-TKI 治疗19 外显子缺失突变可以得到一个比21外显子点突变更长的PFS。通过以上EGFR 与临床病理之间的关系及突变位点的比较，能指导临床方案的选择。临床中可以建议女性NSCLC 患者行EGFR 检测，可以较男性患者更能从EGFR-TKI 药物治疗中获益。虽然腺癌的EGFR 突变率远高于鳞癌，但仍建议鳞癌患者行EGFR 检测，因为仍有10%左右的鳞癌患者能从EGFR-TKI 药物中获益。

3.3 NSCLC 血液与胸水中T790M 突变检测比较

研究发现[9]，使用EGFR-TKI 治疗后进展的肿瘤中，50%存在EGFR 基因20 号外显子第790 位点的突变，即T90M 基因突变。转染携带T790M 基因突变的质粒的肿瘤细胞对EGFR-TKI 的耐药性明显增加。三代TKI（奥西替尼）可用于一线TKI 治疗进展同时检出T790M突变的患者，并能带来长达13 个月的中位PFS[10]。本研究中23 例EGFR-TKI 治疗耐药患者的血液T790M 突变率为52.17%，低于胸水中突变率的65.22%，但差异无统计学意义（P＞0.05），提示对于并发胸腔积液的患者，优先选择胸水检测，而同时检测可以提高检出率，因此即使EGFR-TKI 耐药，仍有50%以上的患者可从三代TKI（奥西替尼、阿美替尼）获益。

综上所述，女性、腺癌患者EGFR 突变较男性、鳞癌患者突变率高，更能从EGFR-TKI 药物中获益；血液、胸腔积液与肿瘤组织相比，对EGFR 突变的检出具有良好的一致性，在失去组织活检的NSCLC 患者，仍可以通过血液、胸腔积液检测EGFR 突变状态；对于一代耐药的NSCLC 患者，密切监测T790M 突变状态，仍有50%以上的患者从三代药物（奥西替尼、阿美替尼）中获益。