续断离子液体提取物质量和药效学评价*

2022-01-05胡献跃黄东纬陈笑笑刁银军

中国药业 2021年24期

胡献跃，黄东纬，陈笑笑，刁银军

（金华职业技术学院，浙江金华 321016）

历代本草将续断列为强筋骨、续折伤良药，其有效成分续断皂苷可诱导大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）向成骨细胞分化和矿化［1］，促进骨形成蛋白2（BMP-2）表达的同时，明显增高其下游关键磷酸化蛋白SMAD1／5／8，P38，ERK1／2 的表达量［2］，还可明显上调成骨细胞护骨因子（OPG）／核因子-κB（NF-κB）受体激活蛋白配体（RANKL）的表达，通过调节成骨细胞的分泌因子而调节破骨细胞的活化［3］，广泛用于治疗骨质疏松症。续断提取工艺的不同会影响提取物的质量和药效，本研究中采用高氯酸显色法、液相色谱-质谱（LC-MS）法和体外释放法测定，评价了续断离子液体提取物与上市对照药材间的质量差异；通过MC3T3-E1 细胞生长和碱性磷酸酶（ALP）活力测定，评价了续断离子液体提取物对成骨细胞的作用；通过测定对破骨细胞RAW264.7 生长和抗酒石酸酸性磷酸酶（StrACP）活力的抑制作用，评价了续断离子液体提取物对破骨细胞的影响。现报道如下。

1 仪器、试药与细胞

1.1 仪器

KQ-500DA 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；LC-MS8045 型液质联用仪（日本岛津公司），配有UV2600 型紫外分光光度计；3111 型CO2水套培养箱（美国热电公司）；Micro Beta 2450 型液体闪烁计数仪，D961962 型细胞收集仪（Perkin Elmer 公司），细胞收集器为FilterMate Harvester；HR40-Ⅱ-A2 型医用净化工作台（青岛海尔特种电器有限公司）；5810R 型低温离心机（德国Eppendorf 公司）；BS210S 型电子天平（德国Sartorius 公司，精度为0.1 mg）；CK40-F200 型倒置显微镜（日本Olympus 公司）；YXQ-208SD 型电热蒸汽灭菌器（嘉兴市中新医疗仪器有限公司）；RCZ-6C3 型智能溶出仪（天津天大公司）。

1.2 试药

离子液体提取物（自制，批号分别为20200630，20200702，20200705，分别含川续断皂苷Ⅵ68.43%，69.21%，68.72%）；续断壮骨胶囊（浙江迪耳药业有限公司，批号为20191004，每粒含续断皂苷提取物0.28 g）；α-MEM 培养液（批号为2005060303），磷酸盐缓冲液（PBS，批号为2005080101），0.25%胰蛋白酶（批号为2004240202），均购自浙江森瑞生物科技有限公司；超级胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批号为19110501）；二甲基亚砜（DMSO，成都市科龙化工试剂厂，分析纯）；氚-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR，中国同辐股份有限公司，产品编号为NET027L，批号为201807，浓度为1 mci／mL，活度为37 Mbq）；ALP 测试盒（货号为A059-1-1，批号为20200724），StrACP 测试盒（货号为A058-1-1，批号为20200803），均购自南京建成生物工程研究所；小鼠重组可溶性NF-κB 受体活化因子配体（sRANKL，美国Peprotech 公司，货号为315-11C，批号为0815612-A2518）；1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐（［Emim］BF4，中科院兰州化学物理研究所，批号为CP0082216，含量≥99%），异绿原酸A 对照品（批号为DST190918-036），异绿原酸B对照品（批号为DST191008-037），异绿原酸C对照品（批号为DST190904-038），马钱苷酸对照品（批号为DST191025-033），绿原酸对照品（批号为DST190906），咖啡酸对照品（批号为DST191030-013），马钱苷对照品（批号为DST200628-038），川续断皂苷乙对照品（批号为DST191202-56），川续断皂苷Ⅵ对照品（批号为DST191126-041），均购自成都德思特生物技术有限公司，含量均高于98.0%。

1.3 细胞

小鼠单核细胞RAW264.7 细胞株（破骨细胞），MC3T3-E1 细胞株（成骨细胞），均由中国科学院干细胞库提供。

2 方法与结果

2.1 续断总皂苷提取物制备

取续断药材100 g，粉碎，过10 目筛，加入0.90 mol／L的［Emim］BF41 000 mL，超声（功率为500 W，频率为40 kHz，下同）提取60 min，滤过，取提取液，置旋转蒸发仪中浓缩至200 mL，加入大孔树脂柱中，用1 个柱体积的水洗至近无色，用3 个柱体积的20%乙醇洗至淡黄色，用60%乙醇洗至近无色，60%乙醇洗脱液旋转蒸发（80 ℃，-0.08 MPa）近干，刮下沉淀物，真空干燥（60 ℃，-0.08 MPa），得续断总皂苷提取物［4-5］。

2.2 续断总皂苷提取物质量分析

2.2.1 续断总皂苷含量测定

线性关系考察：取川续断皂苷Ⅵ对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度为0.5 mg／mL 的溶液。精密量取上述溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，分别置10 mL具塞试管中，于65 ℃水浴氮气流吹干甲醇，精密加入高氯酸5 mL，涡旋混合1 min，65 ℃水浴加热20 min，冰浴放冷。于406 nm 波长处测定吸光度，以吸光度（Y）为纵坐标、溶液质量浓度（X，mg／mL）为横坐标进行线性回归，得回归方程Y ＝9.015X+0.0035（r ＝0.999 1，n ＝5）。结果表明，续断总皂苷质量浓度在0.02～0.10 mg／mL 范围内与吸光度线性关系良好。

含量测定：取样品0.1 g，精密称定，置50 mL 容量瓶中，加甲醇适量，超声处理30 min，放冷，加甲醇稀释并定容，摇匀，过滤。精密量取续滤液3 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇稀释并定容，摇匀，精密量0.4 mL，置10 mL具塞试管中，按线性关系考察项下方法处理，计算总皂苷的含量。结果见表1。

表1 样品中总皂苷含量和川续断皂苷Ⅵ溶出率测定结果（%）Tab.1 The content of total saponins and the dissolution rate of asperosaponin Ⅵin the samples（%）

可见，续断离子液体提取物中总皂苷含量高于续断壮骨胶囊，这可能是由于大孔树脂柱层析不仅除去了离子液体成分，还利用了各成分的极性差异，将多糖等在水和低浓度乙醇中溶解度较高的成分先行洗脱，而皂苷类成分主要集中于60 %乙醇洗脱液中，从而使皂苷类成分得到纯化。

2.2.2 体外溶出度测定

漏槽试验：取续断壮骨胶囊2 粒，置50 mL 容量瓶中，加水适量，超声30 min，溶解，定容，滤过，测得漏槽中溶剂的质量浓度为0.226 mg／mL。

体外溶出度试验：取样品，照浆法测定体外溶出度。以1 000 mL 水为溶出介质，100 r／min 旋转60 min，取溶液10 mL，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。另取川续断皂苷Ⅵ对照品20 mg，加20 %甲醇溶解，定容至100 mL，即得质量浓度为0.2 mg／mL 的对照品溶液。于215 nm 波长处测定吸光度，按外标法计算含量。结果见表1。可见，续断壮骨胶囊中川续断皂苷Ⅵ的溶出率低于续断离子液体提取样品，这是因为其多糖成分含量较高，在水中迅速糊化，抑制水进一步渗透，使川续断皂苷Ⅵ不能释放，造成溶出率较低。

2.2.3 样品中9 种成分含量测定

色谱条件：岛津C18柱（150 mm×2.1 mm，3 μm）；流动相：流动相A 为乙腈-甲醇溶液（6 ∶4，V／ V），流动相B 为0.2%甲酸-水溶液（梯度洗脱程序见表2）；流速：0.4 mL／min；柱温：40 ℃；进样量：10 μL。

表2 流动相梯度洗脱程序（%）Tab.2 Gradient elution program of mobile phase（%）

质谱条件：电喷雾离子源，负离子模式，多反应监测（MRM），雾化气、干燥气、加热气均为高纯氮，流量分别为3，10，10L／min；接口温度：300℃；加热块温度：400℃。通过一级质谱全扫描确定前体离子，根据前体离子进行二级质谱碎裂，确定相应的定性和定量离子，建立离子对，创建MRM 方法。离子对选择及碰撞电压条件参数见表3。

表3 质谱条件参数Tab.3 Parameters of mass spectrum conditions

线性关系考察：分别取异绿原酸A，B，C 及马钱苷酸、咖啡酸、马钱苷、绿原酸、川续断皂苷乙、川续断皂苷Ⅵ9 种对照品各适量，用20% 甲醇配制成质量浓度为0.1 mg／mL 的对照品贮备液。分别取上述对照品贮备溶液各适量，加入20%甲醇稀释成质量浓度为0.5，1.0，2.0，4.0，6.0μg／mL 的各适量系列单一对照品溶液，按上述色谱／质谱条件进样测定。以峰面积（Y）为纵坐标、对照品溶液质量浓度（X，μg／mL）为横坐标进行线性回归。结果见表4。表明各对照品溶液质量浓度在0.5～6.0 μg／mL范围内与峰面积线性关系良好。

表4 线性关系考察结果（n ＝5）Tab.4 Results of the linear relation test（n ＝5）

样品含量测定：取续断离子液体提取物（批号为20200630）和续断壮骨胶囊（批号为20191004）各20 mg，精密称定，加20%甲醇适量，置100 mL 容量瓶中，超声溶解，加20 %甲醇定容，取1 mL，用20%甲醇稀释至50 mL，按色谱／质谱条件进样测定。结果见表5。可见，续断离子液体提取物中有效成分川续断皂苷Ⅵ较续断壮骨胶囊高13.83%。

表5 样品中9 种成分含量测定结果（mg／g）Tab.5 Results of content determination of nine components in the sample（mg／g）

2.3 药效学试验

对MC3T3-E1 及RAW264.7 细胞生长的影响：取对数生长期小鼠单核细胞RAW264.7 细胞株及MC3T3-E1 细胞株，分别制成5×104mL-1单细胞悬液，分别取100 μL 加入96 孔平底培养板中，37 ℃及5%CO2条件下培养24 h 后分别加入含不同质量浓度的续断离子液体提取物／续断壮骨胶囊（1.56～200.00 μg／mL）培养液100 μL，每个浓度做3 个复孔，空白对照组加入相同体积的DMSO，继续培养48 h 后分别加入含0.3 μci3H-TdR 的培养液50 μL，继续培养16 h，收集细胞，测定每个样品的脉冲数，用三孔的平均脉冲数评估各浓度样品对破骨细胞RAW264.7 及成骨细胞MC3T3-E1 生长的影响。结果见表6 和表7。与空白对照组（0 μg／mL）比较，质量浓度为6.25～100.00 μg／mL 的续断离子液体提取物可显著促进MC3T3-E1 细胞生长，且呈量效依赖关系（P ＜0.05），但高浓度（200 μg／mL）时促进作用不明显，提示高浓度的续断皂苷可能存在一定细胞毒性作用。显微镜下可见MC3T3-E1 细胞呈多角形，贴壁生长，几乎无脱落，胞质饱满，相邻细胞生长融合成片，药物作用后的细胞数量明显多于空白对照组，且续断离子液体提取物的作用明显优于续断壮骨胶囊。由表7 和图2 可见，与空白对照组（0 μg ／ mL）比较，质量浓度为12.50～200.00 μg ／ mL 的续断离子液体提取物可显著抑制RAW264.7 细胞生长，且呈量效依赖关系（P ＜0.05）。显微镜下可见RAW264.7 细胞呈多变形，贴壁生长，部分细胞脱落，药物作用后的细胞数明显少于空白对照组，且续断离子液体提取物对RAW264.7细胞的抑制作用优于续断壮骨胶囊。

表6 续断皂苷对成骨细胞MC3T3 -E1 生长的影响（± s，cpm，n ＝3）Tab.6 Effect of asperosaponin Ⅵon the growth of osteroblasts MC3T3 -E1 cells（± s，cpm，n ＝3）

注：与0 μg／mL 比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001。表7 至表9 同。Note：Compared with 0 μg／mL，*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001，as well as Tab.7 to Tab.9.

表7 续断皂苷对破骨细胞RAW264.7 生长的影响（± s，cpm，n ＝3）Tab.7 Effect of asperosaponin Ⅵon the growth of osteoclasts RAW264.7 cells（± s，cpm，n ＝3）

对成骨细胞MC3T3-E1 ALP 活性的影响：取对数生长期的成骨细胞MC3T3-E1 细胞株，胰酶消化后吹打成单个细胞悬液，配成浓度为5×104mL-1的细胞，接种于24 孔板中，每孔1 mL，设2 个复孔，置37 ℃及5 %CO2培养箱中培养24 h 后分别加入含不同质量浓度的续断离子液体提取物／续断壮骨胶囊培养液（6.25～200.00 μg／mL），置37 ℃及5 %CO2培养箱中，继续培养48 h，吸去上清液，PBS 洗涤2 次，每孔加入400 μL 0.1% Triton X-100 以裂解细胞，冰浴10 min。取上清液，用BCA 试剂盒测定裂解液中的蛋白质浓度，按试剂盒操作方法测定ALP 的活性。结果见表8。可见，与空白对照组比较，不同质量浓度的续断离子液体提取物及续断壮骨胶囊均可提高MC3T3-E1 细胞ALP 的活性，但差异不显著（P ＞0.05）。

表8 续断皂苷对成骨细胞MC3T3 -E1 ALP 的影响（± s，U／gprot，n ＝3）Tab.8 Effect of asperosaponin Ⅵon the activity of ALP in osteoblast MC3T3 -E1 cells（± s，U／gprot，n ＝3）

对破骨细胞RAW264.7 StrACP 活性的影响：取对数生长期的破骨细胞RAW264.7 细胞株，胰酶消化后吹打成单个细胞悬液，制成5×104mL-1细胞悬液，接种于24 孔板中，每孔1 mL，设2 个复孔，置37 ℃及5 %CO2培养箱中培养24 h，RANKL 对照组每孔加入50 μL无血清培养基配制的RANKL 和100 μL 无血清培养基，试验组每孔加入以无血清培养基配制的RANKL 50 μL和不同浓度的续断离子液体提取物／续断壮骨胶囊（终浓度6.25～200.00 μg／mL），RANKL 的终浓度为100 ng／mL。置37 ℃及5%CO2培养箱中，继续培养48h，吸去上清液，PBS 洗涤2 次，每孔加入400μL1%TritonX-100 以裂解细胞，冰浴10 min。取上清液，用BCA 试剂盒测定裂解液中的蛋白质浓度，按StrACP 试剂盒操作方法测定StrACP 的活性。结果见表9。可见，与0 μg／mL比较，质量浓度为12.5～200.0 μg／mL 的续断离子液体提取物可显著抑制RAW264.7 细胞StrACP 酶的活性（P ＜0.05）。

表9 续断皂苷对破骨细胞RAW264.7 StrACP 活性的影响（± s，U／gprot，n ＝3）Tab.9 Effect of asperosaponin Ⅵon the activity of StrACP in osteoclasts RAW264.7 cells（± s，U／gprot，n ＝3）

3 讨论

骨质疏松症的发病机制为成骨细胞和破骨细胞失衡，造成骨的形成低于骨的吸收［6-7］。续断提取物中主要成分川续断皂苷Ⅵ可通过促进BMP-2 的生成，调节c-Jun 的磷酸化，激活c-Jun 氨基端激酶（JNK）信号通路，诱导BMSC 向成骨细胞分化，增加骨形成和生长，发挥治疗骨质疏松的作用［8］。且川续断皂苷Ⅵ能提高β 联蛋白（β-catenin）、Runx2 及骨钙素的表达，从而激活Wnt ／ β -catenin 信号通路，进而促进BMSC 的成骨分化［9］。因此，续断提取物可通过多种细胞通路促进成骨细胞的分化与增殖，发挥治疗骨质疏松的作用，但其对破骨细胞的抑制作用仍有待进一步研究［10］。

由表1 可知，续断离子液体提取物中总皂苷含量较续断壮骨胶囊高9.23%，川续断皂苷Ⅵ溶出率高203.90%，提示续断离子液体提取物较续断壮骨胶囊药效更强。由表6 至表9 可知，与空白对照组比较，续断离子液体提取物和续断壮骨胶囊质量浓度均在25～100 μg／mL 范围内可显著促进MC3T3-E1 细胞生长（P ＜0.01）；当续断离子液体提取物的质量浓度为200 μg／mL 时，对MC3T3-E1 细胞的增殖作用反而不明显，预示存在一定的细胞毒性作用，临床使用时应注意给药剂量。但2 种提取物对MC3T3-E1 细胞ALP 活性的影响均不显著（P ＞0.05），这可能是由于ALP 是成骨细胞早期分化的标志物［1］，而本研究中成骨细胞处于生长阶段，故指标变化不显著；2 种提取物质量浓度大于12.5 μg／mL时均可显著抑制RAW264.7 细胞生长，同时还抑制了骨吸收的标志性指标StrACP 的表达［11］，提示2 种提取物均有抑制破骨细胞生长的作用。

综上所述，续断离子液体提取物质量优于续断壮骨胶囊，具有促进破骨细胞RAW264.7 生长和抑制成骨细胞MC3T3-E1 活性的双向作用。