孤立性肺结节患者血清和呼出气冷凝液中微小RNA-21、微小RNA-486检测的临床意义研究

吴丹丹 陈金亮 姚苏梅 何海艳 朱杰 吕学东

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人类健康，其发病率和死亡率均居全球恶性肿瘤首位[1]。70%的肺癌患者被确诊时已进展至晚期[2]，因此早期诊断和治疗对于提高肺癌患者的生存率至关重要。随着胸部CT的广泛应用，越来越多的孤立性肺结节(SPN)被发现，SPN作为Ⅰa期肺癌存在的可能，其术前的良恶性评估尤为重要。恶性SPN的及时手术切除对早期肺癌的预后具有至关重要的影响。但对于形态及血流动力学特征并不典型的SPN，高分辨率CT在其良恶性鉴别诊断上亦存在困难[3]。而传统的肿瘤标记物如癌胚抗原(CEA)等对肺癌的早期诊断价值有限[4]，因此积极寻找新的肿瘤标记物是目前临床研究的热点之一。微小RNA(miRNA，miR)是一类长度为18～25个核苷酸组成的内源性非编码单链小分子RNA，广泛存在于真核生物中[5]，它可以通过mRNA剪切和抑制蛋白翻译的方式对靶基因进行调控，参与发育、增殖、分化、凋亡等多种生物学过程[6]。近年来，许多研究发现miRNA在肿瘤患者组织及体液中广泛存在，与肿瘤的发生、发展密切相关[7]。miR-21位于染色体17p23.2的肿瘤相关基因组区域的脆性位点，具有致癌基因的作用，可通过抑制凋亡基因的表达从而促进肿瘤细胞的增殖[8]。有研究发现肺癌组织中miR-21的表达高出正常水平5倍以上，miR-21的过表达还预示着肺癌患者预后不良[9]。miR-486在多种实体恶性肿瘤中均呈异常表达状态，与肺癌亦高度相关[10]。传统的肿瘤标志物通常通过患者血清、痰液、胸腔积液、支气管肺泡灌洗液(BALF)等标本来检测。呼出气冷凝液(EBC)包含下呼吸道黏膜分泌的液体和挥发性的混合物，可反映气道早期病变。近年来对于血液和肿瘤组织中miRNA的研究报道较多，而EBC中miRNA的相关研究尚少。本研究通过检测SPN患者血清及EBC中miR-486、miR-21水平，对比传统呼吸系统肿瘤相关指标(CEA、细胞角蛋白19片段抗原 Cyfra21-1)，探讨血清及EBC中miR-21、miR-486在SPN患者良恶性的鉴别、病情评估等方面的临床意义。

对象与方法

1.对象：纳入2017年6月～2019年7月于我科和我院胸外科待行活组织检查或手术切除明确病理诊断的SPN患者79例。纳入标准：(1)典型的SPN；(2)既往无肿瘤病史；(3)术前影像学检查无胸腔积液和纵隔淋巴结肿大(>1 cm)；(4)术前检查未发现远处转移。将术后被证实为肺癌的患者作为恶性组(54例)，良性病变患者作为良性组(25例)。同期随机纳入体检的健康者60例作为对照组。本研究经我院伦理委员会审核批准，所有受试者均签署知情同意书。

2.方法

(1)EBC标本收集：健康受试者及SPN患者术前使用Eric Jaeger Company生产的 EcoScreen冷凝器采集EBC标本。在EBC收集前半小时内，不做用力肺活量、时间肺活量、最大通气量等检查。检查前受检者先漱口清洁口腔，戴鼻夹通过单向活瓣平静呼吸，20分钟后取出收集管，待标本融化后可收集到2～4 ml的EBC，然后立即置于-70 ℃低温冰箱内保存。

(2)血清标本收集：SPN患者术前抽取空腹血3 ml置于促凝管中，3 500转/分钟离心5分钟后收集血清，置于-70 ℃冰箱保存待检，对照组受试者血清收集方法相同。

(3)miRNA的检测：本研究采用Stem-loop法进行检测。Stem-loop技术主要包括2个步骤：①设计一个可形成茎环结构的逆转录引物(RT primer)，该引物3’端有6个碱基与成熟miRNA的3’端互补配对，逆转录合成第一链cDNA；②miRNA cDNA与TaqMan探针杂交，并利用设计好的正反向引物进行PCR扩增，当引物PCR延伸到TaqMan探针与eDNA结合位置时，TaqMan探针被置换，荧光基团和猝灭基团分离，随即触发荧光，PCR反应体系中TaqMan探针置换的越多，荧光信号越强。荧光信号的强弱与目标模板量之间存在一定的线性关系，通过荧光信号的收集与监测，即可确定miRNA的表达量。

(4)CEA、Cyfra21-1水平的检测：采用全自动化学发光免疫分析仪检测CEA水平；采用双抗体夹心酶联免疫法检测Cyfra21-1水平，试剂盒购自上海船夫生物科技有限公司，有关操作严格遵循说明书。

结 果

1.病理类型：入选的79例SPN患者中病理检查明确为肺恶性肿瘤者54例(68.35%)，包括腺癌38例，鳞癌12例，小细胞癌4例；明确为良性病变者25例(31.65%)，包括结核8例，炎性假瘤11例，血管瘤2例，曲菌球2例，肺囊肿1例，错构瘤1例。

2.良性组和恶性组患者结节直径比较：良性组患者结节直径[(11.36±7.80)mm]明显小于恶性组[(18.72±7.28)mm]，差异有统计学意义(t=-4.053,P<0.001)。良性组结节直径≤0.8 cm患者比例高于恶性组，结节直径为1.5～3.0 cm患者比例低于恶性组(P<0.05)，而两组结节直径为0.8～1.5 cm患者比例比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 良性组和恶性组不同结节直径患者比例比较[例，(%)]

3.良性组和恶性组患者临床资料比较：良性组和恶性组患者性别、年龄构成比比较差异均无统计学意义(P>0.05)。恶性组有吸烟史和肿瘤家族史患者比例均高于良性组(P<0.05)。见表2。

4.不同直径组SPN患者血清和EBC中miR-21、miR-486水平比较：不同直径组SPN患者血清和EBC中miR-21、miR-486水平比较差异均有统计学意义(P<0.05)。0.8～1.5 cm组和1.5～3.0 cm组患者血清及EBC中miR-21水平均高于≤0.8 cm组，血清及EBC中miR-486水平均低于≤0.8 cm组(P<0.05)，而0.8～1.5 cm组和1.5～3.0 cm组患者血清及EBC中miR-21、miR-486水平比较差异均无统计学意义(P<0.05)。见表3。

表2 良性组和恶性组患者临床资料比较[例，(%)]

5.对照组、良性组及恶性组受试者血清和EBC中miR-21、miR-486、CEA及Cyfra21-1水平比较：对照组、良性组及恶性组受试者血清和EBC中miR-21及miR-486比较差异均有统计学意义(P<0.05)，而3组受试者血清和EBC中CEA及Cyfra21-1水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。恶性组受试者EBC和血清中miR-21水平均高于良性组及健康组，EBC和血清中miR-486水平均低于良性组及健康组(P<0.05)，其余指标两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表4。

6.不同组别SPN患者血清和EBC中miR-21及miR-486水平比较：不同年龄、性别SPN患者及不同病理类型恶性SPN患者血清和EBC中miR-21及miR-486水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)，吸烟组SPN患者血清及EBC中miR-21水平均高于不吸烟组，血清及EBC中miR-486水平均低于不吸烟组(P<0.05)。见表5。

表3 不同直径组SPN患者血清和EBC中miR-21、miR-486水平比较

表4 对照组、良性组及恶性组受试者血清和EBC中miR-21、miR-486、CEA及Cyfra21-1水平比较

表5 不同组别SPN患者血清和EBC中miR-21及miR-486水平比较

7.SPN患者血清与EBC中miR-21、miR-486的相关性分析：Spearman相关分析结果显示，SPN患者血清与EBC中miR-21水平呈直线正相关(r=0.59，P=0.002)；血清与EBC中miR-486水平呈直线正相关(r=0.68，P=0.030)。

8.血清和EBC中miR-21及miR-486评估SPN良恶性的诊断价值：ROC曲线分析结果显示，血清中miR-21诊断恶性SPN的ROC曲线下面积(AUC)为0.774，诊断恶性SPN的敏感性为72.2%，特异性为76.0%。EBC中miR-21诊断恶性SPN的AUC为0.775，诊断恶性SPN的敏感性为83.3%，特异性为64.0%。EBC和血清中miR-21联合检测诊断恶性SPN的AUC为0.816，联合检测诊断恶性SPN的敏感性为81.5%，特异性为76.0%。血清中miR-486诊断恶性SPN的AUC为0.729，诊断恶性SPN的敏感性为76.0%，特异性为66.7%。EBC中miR-486诊断恶性SPN的AUC为0.881，诊断恶性SPN的敏感性为80.0%，特异性为85.2%。EBC和血清中miR-486联合检测诊断恶性SPN的AUC为0.910，联合检测诊断恶性SPN的敏感性为84.0%，特异性为92.6%。

讨 论

近年来，肺癌的发病率和死亡率显著增加，已成为全世界关注的重要问题，早期发现肺癌是成功治疗和预防药物治疗失败的关键因素之一[11]。随着高分辨率CT等检查的普及，临床上发现SPN的比例明显增加，有报道指出正常人群普查发现孤立性肺结节的比例达0.2%[3]。目前SPN的治疗方法主要包括动态观察、活组织检查及手术切除，部分研究者认为对于SPN可以尽可能采取动态观察[12]。本研究结果显示，SPN中恶性的比例为68.35%，以腺癌为主,与相关文献报道一致[13-14]。如此高的恶性比例提醒我们，针对典型的SPN处理需更为积极，必要时及时进行手术治疗。

本研究根据结节直径的不同将SPN患者分为直径≤0.8 cm组(11例)、0.8～1.5 cm组(28例)和1.5～3.0 cm组40例。良性组结节直径≤0.8 cm患者比例高于恶性组，结节直径为1.5～3.0 cm患者比例低于恶性组。此外本研究结果显示，良性组和恶性组患者性别、年龄构成比比较差异均无统计学意义，而恶性组有吸烟史和肿瘤家族史患者比例高于良性组，表明肺癌的发生不仅与环境和吸烟史有关，也与遗传基因的倾向性和家族聚集性有关。因此在鉴别患者SPN良恶性时，患者的吸烟史及肿瘤家族史也是需要纳入考虑的重要因素。

CEA是胚胎发育过程中产生的多糖蛋白复合物抗原，是一种广谱的肿瘤标志物[15]，其在非小细胞肺癌(NSCLC)患者中的表达增加，血清CEA水平也是评判NSCLC患者预后的独立因素[8]。CYFRA21-1是一种上皮肿瘤标志物，与包括肺癌在内的多种常见的上皮恶性肿瘤的发生发展密切相关[16]。本研究中对照组、良性组及恶性组受试者血清和EBC中CEA及Cyfra21-1水平比较差异均无统计学意义，表明传统的肿瘤标志物对于SPN良恶性的鉴别价值有限，积极寻找新的肿瘤标记物迫在眉睫。

MiRNA广泛存在于真核生物中，与肿瘤的发生发展密切相关，大约50%的miRNA在基因组上位于与肿瘤相关的脆性位点上而发挥类似抑癌基因或癌基因的作用[17]。既往研究表明miR-21具有致癌基因的作用，在肺癌细胞系H3255和H441中敲除miR-21可以增强细胞的凋亡效应，NSCLC患者肿瘤组织及血清中miR-21表达增加[8]。本研究亦发现恶性组患者血清及EBC中miR-21水平高于良性组及对照组，而良性组与对照组患者血清及EBC中miR-21水平比较差异无统计学意义。miR-486定位于人类染色体的8p11.21区，既往研究对miR-486在肺癌的不同研究中积累的数据存在争议，有研究发现miR-486可能通过靶向抑制癌基因ARHGAP5从而发挥抑癌因子的作用[18]。Solomides等[19]及Peng等[20]发现miR-486在肺癌组织中的表达水平降低。Zhu等[21]亦发现 miR-486在NSCLC组织中呈低表达，本研究发现恶性组受试者血清及EBC中miR-486水平低于良性组及对照组，而良性组与对照组受试者血清及EBC中miR-486水平比较差异无统计学意义，但Li等[10]的研究结果却显示miR-486在NSCLC患者血浆中的表达水平升高。由于本研究样本量较小，因此miR-486在肺癌患者中的表达及作用机制还需更多的研究来证实。

本研究结果显示，不同年龄、性别及病理类型组SPN患者血清和EBC中miR-21及miR-486水平比较差异无统计学意义，吸烟组患者血清及EBC中miR-21水平均高于不吸烟组，血清及EBC中miR-486水平均低于不吸烟组，且0.8 cm～1.5 cm组和1.5 cm～3.0 cm组患者血清及EBC中miR-21水平均升高，miR-486水平均降低，可能是因为纳入的人群中吸烟SPN患者恶性比例明显增高，而当直径大于0.8 cm时，SPN的恶性比例亦明显增高。本研究证实恶性组患者血清及EBC中miR-21水平明显升高，miR-486水平明显降低，差异均有统计学意义，与上述结果相一致。

对比痰液、血液等传统检测手段，EBC具有无创、简便易行及可重复性高等特点。目前EBC中已检测到100多种反映呼吸系统疾病的生物标志物，其中miRNA由于结构稳定、不易被降解且与肿瘤的发生发展及预后密切相关等优点，已成为近年来肿瘤疾病研究的热点[7]。本研究中，SPN患者血清与EBC中miR-21水平呈直线正相关；血清与EBC中miR-486水平呈直线正相关；血清及EBC中miR-21、miR-486诊断恶性SPN时AUC均>0.7，其敏感度较高，具有较好的诊断价值，同时EBC中miR-21诊断恶性SPN时AUC为0.775，敏感性为83.3%，特异性为64.0%，敏感性明显超过血清，EBC中 miR-486诊断恶性SPN时AUC为0.881，敏感性为80.0%，特异性为85.2%，均超过血清，考虑体液循环中miRNA可能是由组织细胞释放而来[22]，因此，EBC中miR-21、miR-486的检测有潜力作为一种无创方法用于SPN患者的临床诊断。

此外，有研究发现miR-21与NSCLC的铂类耐药[23]和表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)的获得性耐药[24]有关,miR-486水平的变化则与肺癌患者复发密切相关[10]，由于本试验纳入受试者数量尚少，且未能对肺癌患者进行追踪随访，未能明确肺癌患者EBC及血清中miR-21、miR-486的表达与EGFR突变患者疗效、预后及术后复发等之间的关系，需要进一步探讨。

综上，EBC和血清中miR-21及miR-486检测对SPN患者良恶性评估具有较高的临床价值，有助于肺癌的早期诊断和发病机制的研究。采用EBC这种高效、简便、快速、无创的手段检测miRNA，可以作为判断SPN良恶性、筛查肿瘤高危人群的一种新途径。