丁酸钠对高蛋白饲料诱导雏鹅痛风及肠道尿酸转运体蛋白表达的影响

2022-01-05朱道仙

家畜生态学报 2021年12期

朱道仙，陆江，刘莉*，吴植

(1.江苏农牧科技职业学院动物医学院，江苏泰州 225300；2.江苏农牧科技职业学院宠物科技学院，江苏泰州 225300；3.江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室，江苏泰州 225300)

雏鹅痛风近年来在全国范围内大面积暴发，该病主要侵害3周龄以下雏鹅，发病率为10%～50%，死亡率高达50%，耐过雏鹅通常表现为生长发育迟缓，危害严重[1-2]。高尿酸血症是痛风发生的病理基础，主要由于尿酸合成过多或排泄障碍引起[3-4]。尿酸是禽类蛋白质代谢的终产物，饲粮蛋白质含量过大，极易诱导高尿酸血症，已有学者用高蛋白质饲粮和高钙饲粮成功诱导了家禽痛风病例[5-7]。然而，有调查研究发现降低饲料中的蛋白含量对雏鹅痛风防治无显著效果[8]。尿酸排泄障碍可能是雏鹅痛风发生的重要原因，当痛风时肾功能受损，限制了尿酸经肾排泄，经肠排泄成为尿酸排泄主要途径[9]。三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2(ABCG2)是肠上皮细胞中一种高容量尿酸转运体，促进血尿酸向肠腔外排泄[10]。溶质载体家族2成员9(SLC2A9)可使肠中尿酸重吸收进入血液[11]，这两种尿酸转运体调节血尿酸与肠尿酸的平衡。因此，促进尿酸经肠排泄有助于降低血中尿酸水平，从而减少痛风的发生。

近年来，丁酸钠以其增加畜禽采食量、提高日增重和饲料转化率等功能得到了研究者的广泛关注[12-13]。有研究表明，日粮中添加包膜丁酸钠显著提高了14日龄、28日龄扬州鹅体重[14]。但有关丁酸钠调节雏鹅尿酸代谢的报道甚少。本研究通过观察不同丁酸钠添加水平对高蛋白饮食雏鹅血清尿酸代谢、肠道尿酸转运体蛋白表达及痛风的影响，探讨其调节尿酸代谢的可能机制，为丁酸钠在水禽领域的开发应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验设计

选取1日龄扬州雏鹅300只，随机等分为5组，每组6个重复，每个重复10只。分别是正常饲粮对照组(NDC组，粗蛋白质16.5%)、高蛋白组(HPC组，粗蛋白质24%)、低剂量丁酸钠组(LSB组，按0.025%添加于高蛋白饲粮)、中剂量丁酸钠组(MSB组，按0.05%添加于高蛋白饲粮)和高剂量丁酸钠组(HSB组，按0.1%添加于高蛋白饲粮)，试验采取双层笼养，自由采食与饮水，按正常免疫程序免疫，试验周期为18 d。试验饲粮参考美国NRC建议的鹅营养需要量标准配制，其组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels ofthe basic diet(air-dry basis)

1.2 生长性能观察

于6、10、14和18日龄时，以重复为单位对试验雏鹅进行空腹称重，计算平均体重，同时记录采食量，计算平均采食量。试验期间每天观察记录各试验动物的临床表现，当雏鹅具有行动迟缓、缩颈、粪便发白等前期临床症状，剖检后表现为心包增厚，有白色结晶物附着或包被，肾脏苍白肿大、花斑肾，输尿管变粗，直肠末端内容物白色稀粪积聚，标记为疑似发病，试验结束后计算各组发病率。

1.3 血清相关指标测定

分别于6、10、14和18日龄时，每组每个重复随机选取2只接近平均体重的雏鹅，颈静脉采血并装入试管中，在37 ℃水浴锅中静置，待分层后吸取上清液于离心管中，按2 500 r/min离心10 min，取上清液置于4 ℃冰箱中保存，次日检测。血清肌酐(Scr)用改良苦味酸法测定，血清尿酸(UA)用酶比色法测定，血清尿素氮(BUN)用脲酶-谷氨酸脱氢酶法测定，血清黄嘌呤氧化酶活性(XOD)用ELISA法测定。

1.4 肠道尿酸转运体蛋白基因mRNA表达的测定

试验结束后，每组每个重复随机选取1只接近平均体重的雏鹅，致死后取回肠黏膜，用RT-qPCR法检测雏鹅回肠黏膜中三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2(ABCG2)及溶质载体家族2成员9(SLC2A9)的mRNA表达。TRIzol法提取总RNA，在37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s条件下逆转录合成cDNA，然后按如下条件进行扩增：95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s，循环35次。登陆CNBI数据库查找相应基因序列，用Primer-BLAST进行引物设计及特异性检验，最后由上海生工合成，见表2。以β-actin为内参，基因表达量用2-ΔΔCt法计算。

表2 相关基因mRNA表达的引物设计Table 2 Primers for mRNA expression of related genes

1.5 肠道尿酸转运体蛋白表达的测定

用RIPA裂解液提取回肠组织总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，用5×上样缓冲液配平各蛋白样品，上样进行SDS-PAGE电泳2 h，PVDF膜转膜2 h，用5%脱脂牛奶室温封闭2 h。加Ⅰ抗ABCG2(1:2 000)、SLC2A9(1:2 000)和β-actin(1:5 000)，置于4 ℃摇床中孵育过夜，TBST洗膜3次，每次5 min。加辣根过氧化物酶标记兔抗鹅Ⅱ抗(1:5 000)室温下孵育1 h, TBST洗膜3次，每次5 min。化学发光成像仪中显影成像。以β-actin为内参，采用Image J分析软件对各组条带的光密度值进行分析，试验重复3次，取平均值。所有抗体均购于福因德科技(武汉)有限公司。

1.6 数据统计分析

试验数据用SPSS 22.0软件单因素分析方法进行组间差异统计学检验，组内不同时段数值采用重复方差分析，结果用平均值±标准差表示，发病率比较采用卡方独立性检验。P<0.05表示有显著性差异。

2 结果

2.1 丁酸钠对高蛋白饮食雏鹅生长性能的影响

由表3可以看出，HSB组10日龄、14日龄及18日龄采食量均显著高于HPC组(P<0.05)，与NDC组无统计学差异；MSB组14日龄及18日龄采食量显著高于HPC组(P<0.05)，LSB组在各日龄时的采食量与HPC组无统计学差异。HSB组10日龄体重高于NDC组(P<0.05)，14日龄体重高于其他各组(P<0.05)，18日龄体重显著高于HPC组和LSB组(P<0.05)；MSB组18日龄体重高于HPC组(P<0.05)。

表3 丁酸钠对雏鹅采食量及体重的影响Table 3 Effect of sodium butyrate on feed intake and body weight of goslings

2.2 丁酸钠对雏鹅血清尿酸代谢及肾功能的影响

由图1可知，在14日龄时，HPC组及LSB组血中XOD活性最高，显著高于其他各组(P<0.05)，MSB组次之，其后为HSB组，最低为NDC组；18日龄时，各试验组XOD活性有所降低，且HSB组XOD活性显著低于HPC组、LSB组和MSB组(P<0.05)，与NDC组无显著差异(图1A)。各组UA在6日龄、10日龄及18日龄时均低于阈值(400 μmol/L)，各高蛋白试验组UA在14日龄时均高于阈值，表现为高尿酸血症，但给与不同剂量丁酸钠后，血清UA均低于HPC组(P<0.05)，且HSB组UA分别低于MSB组和LSB组(P<0.05)，见图1B。从10日龄起，HPC组反映肾功能的指标Scr及BUN均显著高于NDC组、MSB组与HSB组(P<0.05)，见图1C、图1D。试验期间，HPC组雏鹅痛风发病率约为38%，添加丁酸钠后可降低发病率，HSB组发病率仅为PHC组的一半(图1E)，有统计学差异。

图1 丁酸钠对雏鹅血清非蛋白氮代谢的影响同期比较，柱上标相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下图同Fig.1 Effect of sodium butyrate on serum nonprotein nitrogen metabolism in goslingsIn the same period, the same or absent letters above the columns indicate insignificant difference (P>0.05),different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05). The same below

2.3 丁酸钠对雏鹅回肠中ABCG2、SLC2A9基因mRNA表达量的影响

在分析各组回肠中尿素氨转运体基因mRNA表达差异时发现，与NDC组比较，HPC组ABCG2的mRNA表达下调(P<0.05)；与HPC组比较，不同剂量丁酸钠均可上调ABCG2的mRNA表达，HSB组具有显著差异(P<0.05)(图2A)。HPC组SLC2A9基因mRNA表达量显著高于NDC组(P<0.05)，HSB组及MSB组SLC2A9基因mRNA表达量显著低于HPC组，但高于NDC组(P<0.05)，且HSB组低于MSB组及LSB组(P<0.05)(图2B)。

图2 丁酸钠对雏鹅回肠中ABCG2、SLC2A9基因mRNA表达量的影响Fig.2 Effect of sodium butyrate on the mRNA expression of ABCG2 and SLC2A9 in the ileum of goslings

2.4 丁酸钠对雏鹅回肠中ABCG2、SLC2A9蛋白表达量的影响

从图3可以看出，HPC组回肠中ABCG2蛋白表达量高于NDC组，随着丁酸钠剂量增加有降低趋势，但仅HSB组有显著性差异(P<0.05)。HPC组回肠中SLC2A9蛋白表达量亦高于NDC组，且随着丁酸钠剂量增加有降低趋势，MSB组及HSB组均显著低于HPC组(P<0.05)。

图3 丁酸钠对雏鹅回肠中ABCG2及SLC2A9蛋白表达量的影响A.Western blot结果图；B.ABCG2蛋白相对表达量；C.SLC2A9蛋白相对表达量Fig.3 Effect of sodium butyrate on the protein expression of ABCG2 and SLC2A9 in the ileum of goslingsA. Western blot results; B. Relative expression of ABCG2; C. The relative expression of SLC2A9

3 讨论

研究表明，一定量蛋白日粮可以提高动物的饲料转化率。然而，为了过度追求鹅的快速生长，提高经济效益，在生产实践中常有高蛋白饲粮饲喂雏鹅[15]。本研究发现，高蛋白饲粮在饲喂前期可促进雏鹅快速生长，在10日龄时最为明显，而到18日龄时其生长性能反而会降低，但添加不同剂量丁酸钠后，可显著提高雏鹅体重。说明高蛋白饲粮对不同日龄雏鹅的促生长作用不同，丁酸钠有助于提高高蛋白日粮的促生长作用。

由于禽类的蛋白质分解代谢主要通过嘌呤核苷酸途径形成嘌呤，然后在黄嘌呤氧化酶的作用下被氧化成尿酸，大部分经肾排出体外。然而摄入高蛋白饲粮后可导致体内尿酸生成过多，且尿酸在水中的溶解度较小，易形成高尿酸血症，大量尿酸盐进入肾脏易引起肾损伤，成为痛风的病理基础[16-18]。本研究发现，饲喂高蛋白饲料后，雏鹅在10日龄、14日龄和18日龄时血中UA、XOD活性以及肾脏功能指标Scr及BUN水平均较对照组显著升高，特别14日龄时的UA水平已超过阈值，说明高蛋白可以增加雏鹅高尿酸血症及肾损伤的风险。而高蛋白饮食同时给予不同剂量丁酸钠后均可降低10日龄、14日龄和18日龄时雏鹅血中UA、Scr及BUN水平，呈量效关系。与相关报道丁酸钠可以降低血清中非蛋白氮水平的结论相一致[19]。

研究表明，高尿酸血症或痛风时，尿酸经肠排泄途径代偿性增强[9]。ABCG2是一种高容量的尿酸转运蛋白，在不同肠段均有表达，特别在回肠有大量表达，其功能障碍会导致血清尿酸水平升高[20]。ABCG2基因敲除不仅会导致小鼠血清尿酸浓度增加，并且肠道尿酸的排泄水平明显下降[21]。因此，ABCG2在肠道尿酸排泄中发挥重要作用。本研究发现，高蛋白饲粮可以下调雏鹅回肠中ABCG2的基因mRNA表达，而ABCG2蛋白表达却有所增加，提示基因和蛋白表达不一致。徐象威等[22]在研究基于肠道尿酸转运体 ABCG2的芒果苷降尿酸作用机制分析时也发现了类似的结果。这可能由于蛋白质饲料导致雏鹅产生大量尿酸的刺激，引起回肠中ABCG2蛋白适应性上调，以增加尿酸排泄有关。高剂量丁酸钠可以回调ABCG2的mRNA和蛋白表达，使之趋于正常水平，提示丁酸钠降尿酸作用可能与肠道ABCG2的改变有关。然而，ABCG2是一种多功能蛋白且作用机制复杂，丁酸钠是否通过调节ABCG2蛋白的功能以促进尿酸的肠道排泄，还需进一步验证。

SLC2A9是一种新型的高容量、低亲和力的尿酸转运体[23-24]。有a和b两种亚型。其中b亚型仅分布于肝脏及肾脏，而a亚型除在肾脏中表达外，还在小肠中有所表达[25]，主要功能是将肠腔中尿酸转入肠上皮细胞内，具有促进尿酸重吸收作用。本研究发现，中剂量及高剂量丁酸钠可以显著下调高蛋白饮食雏鹅回肠中SLC2A9的基因mRNA和蛋白表达。表明抑制肠道尿酸重吸收可能是丁酸钠干预尿酸代谢的作用机制之一。