黑藏羊不同部位肌纤维组织学特征的差异分析

2022-01-05吴占月张峰硕桂林生侯生珍

四川农业大学学报 2021年6期

周力，吴占月，张峰硕，桂林生，侯生珍

（青海大学农牧学院，西宁 810016）

肌纤维作为骨骼肌肌肉的基本构成单位，其类型及组成对肉质特性具有明显的调控作用[1]。不同的肌纤维类型具有不同形态特征、收缩以及代谢特征[2]。根据免疫组化的方法可以将其划分为I型（慢速氧化型）、IIA型（快速氧化型）、IIB型（快速酵解型）和IIX型（中间型肌纤维）4种类型[3]，其收缩速率大小为IIB>IIX>IIA>I[4-5]。

据报道，当氧化型肌纤维比例高时，可以改善肌肉色泽，提高嫩度，从而提高肌肉品质[6]，这在青海牦牛试验上有过类似的报道[7]。在不同部位猪肉上也发现[8]，相较于含更多ⅡB型肌纤维，含有更多Ⅰ型肌纤维中血红素铁与高铁肌红蛋白含量会更高，颜色偏红，同时具有更高的pH值与持水力。以上试验结果均说明肌纤维特性与肉质性状间的关系紧密，同时在不同部位间也存在一定的差异。此外，关于苏尼特羊的研究进一步证实[9]，Ⅰ型和ⅡA型肌纤维的数量比例与MyHCⅠ、MyHCⅡA基因的表达量呈正相关，ⅡB型肌纤维的数量比例与MyHCⅡB和MyHCⅡX基因的表达量亦呈正相关，其中ⅡB型肌纤维数量比例与MyHCⅡB基因的表达量呈显著正相关。这进一步表明肌纤维类型以及MyHCs基因的表达丰度的变化紧密相关。目前许多研究者对湖羊[10]、滩羊[11]及黑山羊[12]等肉质进行了大量的研究，但关于黑藏羊肌纤维特性和肉品质之间关系的报道极度匮乏。黑藏羊作为藏系绵羊种类中特有的品种资源[13]。其肉质是一种高蛋白、低脂肪、矿物质含量高，且肉质细嫩、味道鲜美、营养价值高，属于当前人们所追求的优质羊肉[14]。然而传统放牧效率较低，不能满足市场对畜禽产品的需求，因而对黑藏羊进行舍饲就成了一种必然的趋势。

基于此，本研究以舍饲条件下黑藏羊背最长肌、臂三头肌和股二头肌作为试验材料，通过ATP酶染色分析黑藏羊的肌纤维特性，并利用实时荧光定量聚合酶链式反应技术测定肌纤维MyHCs基因的mRNA表达量，旨在为黑藏羊的肉质改进提供理论支持，同时也为我国优质地方肉羊资源的开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

选取20只体况良好、发育健康且平均体重为（10.28±0.43）kg的2月龄青海黑藏羊公羔，在青海贵南县黑藏羊繁育中心进行为期128 d（预试期8 d，正试期120 d）的集中饲养。日粮配方参考中国《肉羊饲养标准》（NY/T 816-2004）进行配制[15]，每天早上08：00和下午17：30进行饲喂，自由饮水，自由采食全混合日粮（total mixed ration，TMR），全混合日粮中精料补充料和粗饲料比例为5∶5，粗饲料由燕麦青贮和燕麦青干草组成（按干物质各占1/2计）。TMR日粮营养成分含量见表1。

表1 TMR日粮营养成分含量（干物质基础）Table 1 Dietary nutrient content of TMR （DM basis） %

1.2 样品采集和制片

试验结束时，选取5只黑藏羊（禁食12 h、禁水2 h）按照颈静脉方式进行放血屠宰。立即采取左半胴体的背最长肌、臂三头肌以及股二头肌组织样，沿着样品肌纤维的方向，切成0.5 cm×0.5 cm×1 cm的肉块，在预冷的异戊烷中脱水干燥30 s，经液氮速冻，制片时将肌肉块放入-25℃的冰冻切片机内切片，厚度为8～10 μm。再利用ATP酶组织化学法对黑藏羊不同部位的肌肉样品进行染色[16]。根据ATP酶染色后颜色最深（黑色）的是Ⅰ型肌纤维，颜色最浅（白色）是ⅡB型肌纤维，介于两者颜色之间（棕褐色）是ⅡA型肌纤维的标准进行判断。

1.3 试验方法

1.3.1 肌纤维特性分析

试验应用显微镜彩图分析软件（Leica Qwin v3）在20×10倍下观察并分析肌纤维特性。每个样本制作4张切片，每张片子随机选择3～5个组织完整的视野进行拍照，使总肌纤维数目大于1 500根[17]。肌纤维横截面最长两点距离与最短两点距离之和的平均值，作为肌纤维直径。圈出每个视野内面积，并统计出每个视野中肌纤维的根数，然后换算成每平方毫米的根数，即为被测样本的肌纤维密度。通过多次测量视野内各型肌纤维的横截面积，求其平均值作为肌纤维横截面积。测出视野内不同类型肌纤维的数量，计算每种类型肌纤维的数量比例。测量每种类型肌纤维的横截面积，求出每种类型肌纤维的面积比例。

1.3.2 MyHCs基因相对表达量测定

屠宰后，分别采集约100 mg黑藏羊背最长肌、臂三头肌以及股二头肌的组织样，立即装入无酶冻存管置于液氮中速冻。使用Trizol法提取不同部位肌肉的总RNA，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，再通过微孔板分光光度计测定其吸光度（OD）值，对符合要求的RNA按照FastQant RT Kit（with gDNase）反转录试剂盒操作步骤反转录成cDNA。按照SYBR Prime ScriptTM RT-PCR Kit进行PCR扩增。反应体系为：1.6 μL cDNA 模板，2×SYBR Rremix ExTaq 10μL，上下游引物各0.4μL （10μmol/L），50×ROX Reference Dye 0.4 μL，加 RNase-free ddH2O 补足到20 μL。扩增后经熔解曲线检测特异性，反应均设空白对照，每个样品设置3个重复。选择肌球蛋白重链Ⅰ（myosin heavy chainⅠ，MyHCⅠ）、肌球蛋白重链 ⅡA（myosin heavy chainⅡA，MyHC ⅡA）、肌球蛋白重链ⅡB（myosin heavy chainⅡB，MyHCⅡB）及肌球蛋白重链ⅡX（myosin heavy chainⅡX，MyHCⅡX）作为目的基因，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作为内参基因，引物由艾博生物技术有限公司设计合成，基因序列设计引物见表2。

表2 荧光定量PCR引物Table 2 Primer sequences used for q RT-PCR

1.4 数据处理

试验相对定量的结果采用2-ΔΔCt法[18]进行计算，原始数据使用Microsoft Excel 2020进行初步处理，采用SPSS 25.0统计分析软件中One-way ANOVA进行方差分析和显著性检验，所得数据以“平均值±标准差（mean±SD）”表示，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 黑藏羊不同部位肌纤维的相关指标分析

肌纤维直径分析结果如表3所示。黑藏羊背最长肌（LD）和臂三头肌（BF）中ⅡA型、ⅡB型肌纤维直径显著低于股二头肌（TF）（P<0.05），而背最长肌（LD）和臂三头肌（BF）中ⅡA型、ⅡB型肌纤维差异不明显（P>0.05）。不同部位肌肉间Ⅰ型肌纤维直径无显著差异（P>0.05）。

表3 黑藏羊不同部位肌纤维直径的比较Table 3 Comparison of muscle fiber diameter in different parts of black Tibetan sheep μm

肌纤维横截面积分析结果如表4所示。黑藏羊股二头肌（TF）中Ⅰ型、ⅡA型、ⅡB型肌纤维横截面积显著高于背最长肌（LD）（P<0.05），但与臂三头肌（BF）中Ⅰ型、ⅡA型和ⅡB型肌纤维横截面积差异不显著（P>0.05）。

表4 黑藏羊不同部位肌纤维横截面积的比较Table 4 Comparison of cross-sectional areas of muscle fibers in different parts of black Tibetan sheep μm2

肌纤维密度分析结果如表5所示。黑藏羊Ⅰ型、ⅡA型和ⅡB型肌纤维密度表现为：背最长肌（LD）>臂三头肌（BF）>股二头肌（TF），但都差异不显著（P>0.05）。

表5 黑藏羊不同部位肌纤维密度的比较Table 5 Comparison of muscle fiber density in different parts of black Tibetan sheep N·μm-2

肌纤维数量比例分析结果如表6所示。背最长肌（LD）中Ⅰ型肌纤维数量比例为12.55%，分别比臂三头肌（BF）、股二头肌（TF）高出了0.21%和0.63%，但各组间都差异不显著（P>0.05）。股二头肌（TF）中ⅡA型肌纤维数量比例显著低于背最长肌（LD）（P<0.05），较臂三头肌（BF）差异不显著（P>0.05）。不同部位肌肉间ⅡB型肌纤维数量比例差异不显著（P>0.05）。

表6 黑藏羊不同部位肌纤维数量比例Table 6 Muscle fiber quantity proportion of black Tibetan sheep in different parts %

肌纤维面积比例分析结果如表7所示。黑藏羊Ⅰ型肌纤维面积比例以背最长肌（LD）中最高，分别比臂三头肌（BF）和股二头肌（TF）高于1.64%、2.48%，其中背最长肌（LD）与股二头肌（TF）差异显著（P<0.05）。不同部位肌肉间ⅡA型和ⅡB型肌纤维面积比例差异不显著（P>0.05）。

表7 黑藏羊不同部位肌纤维面积比例Table 7 Muscle fiber area ratio of black Tibetan sheep in different parts %

2 黑藏羊不同部位肌肉相关基因的表达

不同部位肌肉中MyHCs基因的表达量结果如图1所示。背最长肌MyHCⅡA基因的表达量高于臂三头肌、股二头肌，其中背最长肌与股二头肌间差异显著（P<0.05）。MyHCⅡB和MyHCⅡX基因的表达量表现为背最长肌<臂三头肌<股二头肌（P>0.05），而MyHCⅠ基因的表达量则相反（P>0.05）。由此可见，黑藏羊MyHCⅡA基因的表达量在不同部位肌肉中存在较大差异。

图1 黑藏羊不同部位肌肉中MyHCs基因的表达量（n=5）Figure 1 Expression of MyHCs gene in different parts of black Tibetan sheep

3 讨论

肌纤维类型组成与其肉质性状密切相关[19]。影响骨骼肌中肌纤维组织学特性的因素有许多，如年龄、品种、性别、激素、活动量以及饲粮类型等，其中部位也是一个重要方面[20]。诸多试验研究证实，不同部位肌肉中肌纤维类型组成通常存在较大的差异[21-23]。因此，若能了解动物肌肉中肌纤维类型分布规律对于研究机体生长、发育、代谢以及肉质特性均具有重要的意义[24]。在猪上研究表明[25]，肌肉的嫩度、色泽与Ⅰ型和ⅡA型肌纤维比例呈正相关，但与ⅡB型肌纤维比例呈负相关。在西门塔尔公牛上试验发现[26]，肌纤维特性影响肉品质，特别是肌肉的质构特性，提高Ⅰ型纤维比例和降低ⅡB型纤维比例能够改善肉质嫩度。侯艳茹等[27]曾报道称，与舍饲相比，放牧饲养能够通过提高AMPKα2的mRNA相对表达量，增强机体线粒体生物合成水平和氧化代谢能力，促使肌纤维类型由酵解型（ⅡB型+ⅡX型）向氧化型（Ⅰ型+ⅡA型）转化，继而改善肌肉品质。本研究利用ATPase碱孵育法对黑藏羊不同部位肌肉肌纤维类型组成进行分析，结果发现在不同部位肌肉中均检测到Ⅰ、ⅡA和ⅡB 3种肌纤维类型，背最长肌氧化型肌纤维数量比例>臂三头肌氧化型肌纤维数量比例>股二头肌氧化型肌纤维数量比例，这与上述人员研究结果基本类似。说明肌肉中氧化性肌纤维所占比例越高，肌肉品质越好，而酵解型肌纤维则相反。

肌纤维类型转化与MyHCs基因表达对肉品质的调控具有重要作用[28]。尹丽卿等[29]试验表明，苏尼特羊背最长肌、股二头肌及臂三头肌的MyHCⅠ基因表达量与剪切力值均呈负相关，而MyHCⅡB和MyHCⅡX基因表达量与剪切力值呈正相关，MyHC-ⅡA基因表达量和a*值呈显著正相关。侯普馨等[30]进一步证实，MyHCⅠ和MyHCⅡA基因mRNA相对表达量均与Ⅰ型和ⅡA型肌纤维数量比例和面积比例呈正相关；MyHCⅡB基因和MyHCⅡX基因mRNA相对表达量均与ⅡB型肌纤维的数量比例和面积比例呈正相关。由此可知，MyHCs基因表达量与ATPase组织化学染色法对肌纤维的分型结果基本都是一致的。而本试验通过RT-qPCR技术对与黑藏羊肌纤维中MyHCs的基因表达量进行检测，发现背最长肌MyHCⅡA基因的表达量高于臂三头肌、股二头肌，其中背最长肌与股二头肌间差异明显。表明不同部位肌肉中MyHCs基因表达水平存在一定的差异性。提示黑藏羊的肌纤维特性可以作为衡量不同肌肉部位品质的重要指标，如何提高不同部位肌肉中氧化性（Ⅰ型+ⅡA型）肌纤维的所占比例来改善羊肉品质是团队未来研究的重要方向。