自噬在围着床期小鼠子宫内膜中作用初探

申萌萌，刘雁峰，马小娜，贾静，王峥，朱庆文

胚胎着床是一个复杂的生理过程，过程中子宫内膜能够允许具有着床能力的胚胎定位、黏附、植入是成功着床的关键。在胚胎着床这个动态过程中，许多生理活动参与其中。自噬是真核生物降解、回收细胞内生物大分子和受损细胞器的过程，对细胞能量代谢、维持细胞稳态等发挥重要作用[1-2]。有研究表明，自噬存在于子宫内膜间质细胞和上皮细胞中，并参与子宫内膜的生理和病理过程[3-5]。自噬是否影响子宫内膜的容受性，并参与调控胚胎着床过程，是近年研究的热点问题。本研究结合动物实验，选择妊娠第4～6 天小鼠子宫，观察自噬在胚胎围着床期小鼠子宫内膜中的作用，以对自噬在胚胎着床过程中的作用机制进行初步探索。

1 材料与方法

1.1 实验动物选择7～8 周龄specefic pathogen free（SPF）级ICR 雌性小鼠36 只，未交配过，20 只雄性小鼠证明有生育能力，雌性体质量（20±2）g，雄鼠体质量（25±2）g。由北京维通利华实验技术有限公司提供，生产许可证号：SCXK（京）2012-0001。小鼠饲养环境，湿度为5%～10%，温度为（22±2）℃，12 h/12 h 光照/暗循环，可以自由获取食物和饮水。本动物实验严格按照北京中医药大学动物伦理委员会的批准，编号：BUCM-4-2020110902-4108。

1.2 实验试剂及仪器米非司酮规格25 mg/片，批号：H10950003，购买于北京中医药大学第三附属医院药房，制备成浓度为0.8 mg/mL 的油剂。Anti-LC3B（ab48394；英国艾博抗公司）；稳压稳流电泳仪（美国伯乐公司）；垂直电泳槽（美国伯乐公司）；半干转电转印仪（美国伯乐公司）；2.5%戊二醛；透射电镜，日本HITACHI H-7650。

1.3 实验方法

1.3.1 分组及造模 每日16:00，雌雄小鼠按照2:1 合笼，次日晨检查阴栓，发现阴栓（即雌鼠与雄鼠成功交配）记为妊娠第1 天（the first day of pregnancy，pd1）。将妊娠小鼠按照随机数字表，分为空白组、模型组各18 只，每组又分为pd4、pd5、pd6 3 个小组，每小组6 只小鼠。于pd1 开始空白组和模型组每日灌服生理盐水0.2 mL，连续5 d。空白组（pd4）早上9:00皮下注射麻油0.1 mL，模型组注射米非司酮油剂0.1 mL，制备成胚胎着床障碍模型。

1.3.2 取材 分别于pd4、pd5、pd6 16:00 将各组小鼠脱颈处死，裸眼观察各组小鼠妊娠情况，计数胚胎着床位点数；其中3 只小鼠子宫投入2.5%戊二酸，备透射电镜检测；另3 只小鼠子宫组织保存于-80 ℃备蛋白质印迹（Western blotting）检测。

1.3.3 胚胎着床情况观察 裸眼观察pd4、pd5、pd6 两组小鼠的子宫外观，胚胎着床情况。记录各组胚胎平均着床位点数。平均着床位点数=该组小鼠总着床位点数目/该组妊娠小鼠数目。

1.3.4 Western blotting 方法检测围着床期小鼠子宫内膜组织中LC3-Ⅱ蛋白的表达 分别提取pd4、pd5、pd6 各组小鼠组织的蛋白，加入细胞裂解液，取上清液，BCA 法测定蛋白定量。配制10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液，水封闭，静置1 h；缓缓加入5%浓缩胶。处理好的样品按顺序加入浓缩胶的上样孔内，每张胶上加入10 μL 的蛋白标记。采用半干电转移仪进行蛋白质的电转移，转移至聚偏二氟乙烯膜上。用5%脱脂奶粉在吐温三羟甲基氨基甲烷缓冲液中封闭，室温振荡60 min。一抗4 ℃封闭过夜，二抗37 ℃震荡60 min。化学发光试剂显影。Image-Pro Plus 6.0 软件分析目的条带。

1.3.5 透射电镜观察围着床期小鼠子宫内膜细胞中自噬小体的表达 0.01 moL/L 磷酸盐缓冲液进行漂洗，共3 次，每次15 min，放置于新锇酸溶液中固定2 h；0.01 moL/L 磷酸盐缓冲液冲洗3 次，分别用50%、70%、90%、100%乙醇逐级脱水，每次10 min，环氧树脂包埋，定位，制成超薄切片，醋酸双氧铀染色；最后HITACH H-7650 透射电子显微镜下观察子宫内膜细胞自噬小体表达情况。

1.4 统计学方法所有数据采用SPSS 20.0 统计软件进行分析。定量资料符合正态分布数据采用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD 法；不符合正态分布数据采用中位数和四分位数[M（P25，P75）]表示，两个独立样本比较采用Wilcoxon 秩和检验，多个独立样本比较采用KrusKal-Wallis H 秩和检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 子宫形态裸眼观察各组小鼠子宫形态，空白组pd4 小鼠子宫无明显串珠样改变；pd5 可见串珠样改变，串珠分布均匀；pd6 串珠样改变明显，分布均匀。模型组pd4 小鼠子宫纤细，无串珠样改变；pd5子宫可见积血，无明显串珠样改变；pd6 可见少量串珠样改变，孕体大小不均，串珠分布不均。见图1。

图1 各组小鼠子宫形态

2.2 胚胎着床位点数空白组中胚胎着床位点数比较，pd5 较pd4 有增多，但差异无统计学意义（P＞0.05）；pd6 较pd4 增多，差异有统计学意义（P＜0.05）。模型组pd4、pd5、pd6 胚胎着床位点数差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组pd5、pd6 平均着床位点数分别低于空白组pd5、pd6 的平均胚胎着床位点数（P＜0.05，P＜0.01），见表1。

表1 各组小鼠妊娠第4、5、6 天胚胎着床位点数[M（P25，P75）]

2.3 围着床期小鼠子宫内膜中LC3-Ⅱ蛋白的表达空白组和模型组LC3-Ⅱ蛋白水平均表现出pd5 较pd4 降低，pd6 再升高的趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。pd4 模型组LC3-Ⅱ表达低于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图2 围着床期小鼠子宫内膜中LC3-Ⅱ蛋白的表达（n=3）

2.4 围着床期小鼠子宫内膜细胞中自噬小体的表达空白组和模型组pd4、pd5、pd6 子宫内膜细胞中均可见自噬小体表达。透射电镜下可见空白组小鼠子宫内膜细胞完整，细胞内细胞器形态正常，pd5 子宫内膜腔上皮细胞表面可见蘑菇样凸起——胞饮突表达丰富。空白组pd4 子宫内膜细胞内自噬小体数量多，pd5 出现减少，pd6 又增多。模型组部分子宫内膜细胞受到破坏，出现细胞坏死。模型组pd4 细胞中自噬小体较空白组多，亦较模型组pd5、pd6 自噬小体表达多。见图3。

图3 围着床期小鼠子宫内膜细胞中自噬小体的表达（×5 000）

3 讨论

自噬是真核细胞通过溶酶体清除受损细胞器和异常蛋白等的主要方式之一，是细胞的一种生存防御机制。适度的自噬可维持细胞稳态，异常的自噬则与某些疾病的发生、发展有关。子宫内膜容受性低是指子宫内膜允许胚胎定位、黏附、植入的能力降低，造成胚胎着床失败、妊娠率降低[6]。有研究显示，自噬活动存在于子宫内膜细胞，并受雌孕激素的影响在月经周期中发生变化[7]。那么自噬是否在胚胎着床过程中发挥作用？自噬调控异常是否与子宫内膜容受性降低有关呢？基于这些思考，本研究观察小鼠妊娠第4、5、6 天[8]，即围着床期子宫内膜的自噬变化情况，以初步探讨自噬在胚胎着床过程中的作用。

本研究发现，空白组小鼠围着床期子宫内膜自噬水平发生波动，随着胚胎黏附植入于子宫内膜以及内膜蜕膜化进程，自噬标记物LC3-Ⅱ、自噬小体的表达于pd5 出现减少，pd6 初级蜕膜化区形成后自噬水平出现回升。Su 等[9]对自噬在胚胎着床期子宫内膜中的作用进行研究，发现胚胎植入时自噬标志物水平较植入前有降低趋势。说明自噬参与胚胎着床的过程，并在过程中起到一定的作用。

胚胎着床障碍小鼠模型是研究子宫内膜容受性的常用动物模型，采用米非司酮制备，模拟子宫内膜容受性低的状态。米非司酮是药物流产的临床经典用药，与孕酮受体竞争性结合以抑制孕酮作用，造成子宫内膜细胞自噬增强[10]。本研究观察该模型下子宫内膜的自噬水平以了解子宫内膜容受性降低是否与自噬水平异常有关。结果发现，米非司酮制备的着床障碍模型小鼠子宫内膜细胞中自噬小体增多，具有凋亡倾向，部分细胞出现破坏、死亡，与孙敬霞等[11-12]研究相一致。LC3-Ⅱ是自噬小体形成的结构蛋白，附着于自噬小体膜上，是反映自噬水平的重要标志物[13]。本研究发现，模型组小鼠子宫内膜自噬小体表达水平高，但LC3-Ⅱ蛋白表达却低于空白组，考虑LC3-Ⅱ水平降低与模型组细胞破坏、死亡有关。说明自噬参与并调控胚胎着床过程，过度自噬还可导致细胞自噬依赖性死亡[14]，降低胚胎着床率。

目前对于胚胎着床过程中自噬是如何激活和调控的并不明确，可能由于胚胎在植入子宫内膜过程中，缺氧激发子宫内膜的自噬机制[15-16]。已有研究发现雌孕激素能对自噬产生抑制作用[17-18]，亦可能是黄体中期高水平雌孕激素调控子宫内膜细胞自噬，进而促进胚胎着床，但对于其具体的调节机制并不清楚。

综上，自噬在胚胎着床过程中发挥重要作用，适度的子宫内膜自噬可能与维持子宫内环境稳态及胚胎正常植入能力密切相关，自噬异常可能破坏子宫内膜细胞活性和功能，造成子宫内膜容受性降低，不利于胚胎着床。目前对于胚胎着床过程中子宫内膜的自噬调控机制并不明确，值得深入研究，未来结合细胞实验进一步探索。