GRP78蛋白在胃癌中的表达及作用

李素云， 袁靖哲， 李 玄， 孟星圻， 刘 轩， 邓 靖， 贺修胜

(南华大学衡阳医学院 1.应用解剖与生殖医学研究所，2.临床医学专业，3.肿瘤研究所，4.预防医学专业，湖南省衡阳市 421001)

胃癌(gastric carcinoma，GC)是消化道最常见的恶性肿瘤之一，严重危害人们的生命与健康。由于胃癌早期症状不明显，所以多数胃癌患者就诊时已为中晚期，且其疗效欠佳，5年生存率低。研究表明，胃癌的发生发展与多种基因表达异常有关，蛋白质是基因的表达产物，可作为胃癌发生的诊断标志物。目前临床用于判断胃癌发生的标志物主要有CEA、CA72-4和CA19-9，但其特异性不高[1-2]。因此，筛选并鉴定胃癌早期诊断的分子标志物，寻找早期诊断的新方法，是胃癌早诊断、早治疗、改善患者生活质量及提高5年生存率的关键。

葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)也称免疫球蛋白重链结合蛋白。GRP78蛋白高表达于多种肿瘤细胞中，参与肿瘤细胞增殖、免疫逃逸、转移及血管新生等病理和病理生理过程，GRP78蛋白可作为肿瘤预后不良的标志物，但其在胃癌组织中表达情况及作用机制尚不清楚[3-4]。本研究观察GRP78蛋白在胃癌组织中表达水平及其对胃癌细胞系增殖和迁移的影响。

1 材料和方法

1.1 标本与细胞

胃癌标本48例，癌旁正常胃黏膜组织28例(癌旁5 cm以上)，均由南华大学附属第一医院病理科赠予。胃癌标本中高、中分化32例，低分化16例；伴淋巴结转移胃癌组织26例，手术取材后立即放入液氮罐中保存，经甲醛固定，制成石蜡切片以备用。SGC-7901及GRP78-shRNA2-SGC-7901细胞株由肿瘤研究所保存。

1.2 主要试剂

RPMI-1640培养液购自HyClone公司；胎牛血清购自四季青公司；0.25%胰蛋白酶(含EDTA)购自Genview公司、DMSO购自Solarbio公司；EDTA购自Sigma公司；Lipofectamine2000脂质体购自Invitrogen公司；鼠抗人单克隆抗体GRP78购自Abcam公司；鼠抗人GAPDH多克隆抗体购于上海科敏生物科技有限公司；HRP标记羊抗鼠抗体购于武汉博士德生物有限公司。

1.3 免疫组织化学法检测GRP78蛋白的表达

制作石蜡切片，免疫组织化学染色法分析GRP78蛋白在胃癌和癌旁组织中的表达。二甲苯和梯度酒精脱水处理切片；EDTA抗原缓冲液置微波抗原修复，PBS洗3次，每次5 min；3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶；3%牛血清白蛋白封闭；PBS清洗3次，每次5 min；一抗(1∶500)，4 ℃冰箱孵育过夜，PBS清洗3次，每次5 min；二抗孵育2 h，PBS清洗3次，每次5 min；DAB显色。

1.4 MTT法检测GRP78对胃癌细胞增殖的影响

用含10%胎牛血清1640培养基配成细胞液，每孔100 μL，约2 000个细胞接种至96孔板，设3个复孔；置37 ℃、5% CO2的恒湿培养箱中培养，分别于24、48、72、96、120 h后取出，每孔加20 μL MTT溶液，于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中，孵育4 h，弃孔内液体，每孔加160 μL DMSO，振荡12 min，充分融解结晶；酶标仪490 nm波长处进行检测，记录结果。以增长率或者抑制率为纵坐标，时间为横坐标，绘制出细胞生长曲线图。

1.5 Transwell方法检测GRP78对胃癌细胞侵袭迁移的影响

基质胶铺板，制备细胞悬液，调整细胞水平至1×106/mL；接种细胞，取100 μL加至Transwell小室的上室，在下室中加600 μL完全培养液；置培养箱中培养48 h，取出小室，用棉签擦去上室细胞，4%多聚甲醛固定15 min，PBS清洗1次，0.1%结晶紫染色20 min，PBS清洗1次，显微镜下观察细胞穿过小孔情况，拍照并统计穿过的细胞数。

1.6 统计方法

2 结 果

2.1 各组GRP78蛋白阳性表达比较及其与临床病理特征的关系

GRP78蛋白表达产物GRP78蛋白位于胞质，且在胃癌组织中GRP78蛋白较正常胃黏膜组织明显增加(图1)。其阳性表达率与胃癌的直径、分化、淋巴结转移、分期、复发有关(P<0.05；表1)。

表1 胃癌组织中GRP78蛋白表达与临床病理特征分析 单位：例(%)

图1 免疫组化检测GRP78蛋白在不同胃癌组织中的表达情况(结晶紫染色，40×)A为正常胃黏膜；B为癌旁组织；C为胃转移癌；D为高分化胃癌组织；E为中分化胃癌组织；F为低分化胃癌组织。

2.2 GRP78蛋白对SGC-7901细胞增殖能力的影响

与SGC-7901组比较，GRP78-shRNA2组细胞增殖能力显著降低(P<0.05)，即下调GRP78蛋白能抑制SGC-7901胃癌细胞的增殖能力(图2)。

图2 MTT检测GRP78-shRNA2质粒转染后对SGC-7901细胞增殖能力的影响a为P<0.05,与SGC-7901比较。

2.3 GRP78蛋白对SGC-7901细胞迁移能力的影响

GRP78-shRNA2组迁移细胞数显著低于SGC-7901组(P<0.05；图3)，即下调GRP78蛋白表达能降低SGC-7901胃癌细胞的迁移能力。

图3 Transwell检测GRP78低表达对SGC-7901胃癌细胞迁移能力的影响A为结晶紫染色(40×)；B为迁移细胞数直方图。a为P<0.05,与SGC-7901比较。

3 讨 论

近年来，应用微阵列及比较基因组杂交等技术对胃癌细胞DNA或mRNA进行了研究，明确了部分与胃癌发生发展相关的基因[2]。蛋白质是生命功能活动的执行者，基因经转录翻译成蛋白质后，还将进行折叠或修饰才能发挥其功能，因此，从基因水平不能全面反映出胃癌细胞内蛋白质变化。随着蛋白组学和分子生物学技术的不断发展，研究肿瘤发生发展相关蛋白质分子，为寻找胃癌早期诊断标志物奠定了基础[5]。

葡萄糖调节蛋白78以分子伴侣形式参与蛋白质折叠与转运，附着在内质网上，属于应激蛋白，缺氧和低糖环境呈高表达状态[6]。研究发现，GRP78蛋白高表达于肝细胞癌、结直肠癌、胃癌等肿瘤细胞中，其蛋白的高低可作为肿瘤预后不良的标志物，且GRP78蛋白在肿瘤细胞化疗耐药中发挥着关键作用[7-8]，GRP78蛋白是通过何种机制参与这些肿瘤的发生发展尚不清楚，但GRP78蛋白在多种肿瘤高表达，提示GRP78蛋白在肿瘤发生发展中可能扮演着重要角色。GRP78蛋白通过多种信号通路，广泛参与了肿瘤细胞增殖、凋亡抵抗、免疫逃逸、转移和血管新生等病理和病理生理过程[9]。有研究报道，GRP78蛋白对细胞的凋亡具有抑制作用，并经过未折叠蛋白反应(UPR)，使细胞数量增多[10]。肿瘤细胞表面GRP78蛋白是肿瘤信号转导和活性的重要调节剂，能快速激活细胞表面其他蛋白受体或配体，能通过磷酸肌醇Ⅲ激酶/Akt信号通路，调控肿瘤细胞增殖和侵袭迁移[11-13]。然而，有关GRP78在胃癌组织中表达的临床病理意义及其在胃癌转移中的作用机制尚不清楚。

本研究运用免疫组织化学技术检测胃癌组织中GRP78蛋白的表达水平，并分析其与胃癌转移、临床分期和病理分型等临床指标，结果表明GRP78蛋白高表达于胃癌组织中，其表达与胃癌的直径、分化、淋巴结转移、分期、复发等有关。课题组前期成功建立了GRP78-shRNA2-SGC-7901胃癌细胞株[14]，通过MMT检测GRP78蛋白低表达时对SGC-7901细胞增殖能力的影响；Transwell结果表明，降低GRP78蛋白表达能抑制胃癌SGC-7901细胞的增殖和迁移能力。综上，GRP78蛋白可能参与了胃癌的发生发展，但其具体作用机制还需进一步研究。