前列腺癌患者Hedgehog信号通路相关蛋白的表达及其临床意义

张建坤， 张 航， 钱亚娜， 李业山， 董立军

(河北中石油中心医院泌尿外科，河北省廊坊市 065000)

前列腺癌是男性尤其是老年男性常见的恶性肿瘤性疾病，早期筛查其术后复发高危人群，能够有效降低其复发率。前列腺癌早期诊断的生物学指标也是目前临床及基础研究的重点。Hedgehog(Hh)信号通路已经被证实在胚胎发育、器官稳态维持等方面发挥重要作用[1]。近年来，通过对肿瘤治疗靶点的深入研究，发现Hh信号通路对肿瘤细胞的恶性生物学行为具有显著的促进作用[2]，因此，推测Hh信号通路可能是调控癌症发生发展的重要分子机制。目前关于Hh信号通路与前列腺癌病情及预后关联的研究开展较少，因此本研究通过检测前列腺癌患者Hh信号通路Shh、Ptch和Gli1蛋白表达水平，分析其表达与前列腺疾病严重程度和预后的关系，为其临床治疗提供参考。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选取本院2014年1月—2016年1月经手术治疗病理确诊的前列腺癌患者90例，年龄51～83岁，均取前列腺癌组织及病灶周边<3 cm癌旁正常组织。根据肿瘤标本组织镜下癌细胞及间质的分化程度进行Gleason评分[3]。本研究获得本院伦理委员会批准，患者及家属均知情同意。

纳入标准：①首次确诊并接受手术治疗；②术前未经内分泌、放射治疗等其他治疗方式；③临床资料完整。排除标准：①合并其他原发恶性肿瘤；②不配合相关治疗；③术中标本污染。病例脱落标准：①拒绝随访；②随访期失联；③随访期因其他因素导致死亡。

1.2 免疫组织化学测定Hh信号通路相关蛋白表达

前列腺癌样本、癌旁正常组织样本离体后，经10%中性甲醛固定48 h，石蜡包埋并4 μm切片。切片脱蜡水化后高温高压热修复，3%双氧水室温封闭10 min，与Shh、Ptch和Gli1一抗孵育过夜后，二抗孵育30 min，PBS冲洗3次，每次2 min，DAB显色。其后蒸馏水冲洗并苏木精染色，用PBS代替一抗作为阴性对照。Shh、Ptch和Gli1蛋白在前列腺癌细胞的阳性表达均位于胞核、胞质，根据染色细胞百分率、染色强度对结果进行判读。染色细胞百分率：着色细胞占计数细胞≤10%为0分，10%～25%为1分，25%～50%为2分，50%～100%为3分。染色强度：淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。上述两种得分的乘积为每张切片着色程度得分，≤1分为阴性(-)、2～3分为弱阳性(+)、4～6分为阳性(++)、>6分为强阳性(+++)，弱阳性、阳性、强阳性统称为阳性。

1.3 生存时间的观察

以术后次日作为随访起点，2020年1月1日或该时间点前患者死亡的时间点作为随访终点，采用门诊复诊、电话等方面进行随访，以血清前列腺特异性抗原(prostate specific antigen，PSA)、影像学检查等方法明确复发或转移的时间间隔作为无进展生存时间或者总生存时间。

1.4 统计学方法

数据经SPSS 20.0软件处理，计数资料以例(%)表示，组间比较采用χ2检验；生存结局影响因素的分析采用Cox回归模型；生存时间比较采用Kaplan-Meier生存分析。以P<0.05为差异有显著性。

2 结 果

2.1 前列腺癌组织、癌旁正常组织中Hh信号通路相关蛋白表达的比较

前列腺癌组织中Hh信号通路相关蛋白Shh、Ptch和Gli1的表达水平明显高于癌旁正常组织(图1)，说明前列腺癌伴随着Hh通路相关蛋白高表达。

图1 前列腺癌组织Hh信号通路相关蛋白表达(免疫组化，400×)

2.2 Hh信号通路相关蛋白表达与前列腺癌病理特征的相关性

不同Shh、Ptch和Gli1蛋白表达的前列腺癌患者临床TNM分期、Gleason评分、合并骨转移的分布差异有统计学意义(P<0.05；表1)。

表1 Hh信号通路相关蛋白表达与前列腺癌病理特征的相关性 单位：例(%)

2.3 前列腺癌复发转移影响因素的Cox分析

多因素Cox回归分析显示：临床TNM分期Ⅲ、Ⅳ期、Gleason评分>7分、合并骨转移、Shh蛋白表达阳性、Ptch蛋白表达阳性、Gli1蛋白表达阳性分别是前列腺癌患者术后复发转移的独立危险因素(P<0.05；表2)。

表2 前列腺癌无进展生存期影响因素的Cox分析

2.4 Hh信号通路蛋白表达与前列腺癌患者无进展生存期的关系

根据前列腺癌组织中Shh、Ptch和Gli1表达情况，将患者按3种蛋白分别分为阴性组及阳性组。Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示，蛋白阴性组患者的无进展生存时间均显著长于蛋白阳性组(图2；P<0.05)，提示Hh信号通路蛋白(Shh、Ptch和Gli1)表达与患者无进展生存期呈负相关。

图2 不同Shh、Ptch和Gli1蛋白表达的前列腺癌患者无进展生存期的Kaplan-Meier曲线

3 讨 论

前列腺癌是男性发病率最高的恶性肿瘤之一。前列腺癌经手术治疗的疗效较为理想，患者的5年生存率较高，但术后早期的复发转移是导致患者总生存率下降的直接原因。因此，探索前列腺癌复发转移的分子机制，发现前列腺癌早期诊断的生物学指标，对改善前列腺癌患者的预后具有重要意义。Hh信号通路是一种进化保守的通路，在脊椎动物和无脊椎动物的胚胎发育中起到重要作用，能够调控伤口及组织愈合、维持细胞干性[4]。经典的Hh信号通路由Hh配体、2个跨膜受体(Ptch、Smo)、下游核转录因子Gli及一些中间传递分子组成；当Hh信号通路分子存在时,Ptch与Smo组成的受体复合物的空间构象发生改变,Ptch对Smo的抑制作用被解除后,Smo向细胞内呈递信号,并将信号呈递给转录因子Gli，激活后的转录因子Gli进入细胞核能够促进目的基因的表达[5]。

通常情况下，Hh信号通路的活性较低[6]；在肿瘤细胞中，Hh信号通路参与了多种肿瘤在不同阶段的发生发展过程。研究发现，当Hh通路激活时，可通过表达Shh、Ptch、Smo和Gli等多重组分，从而调控细胞的增殖、抑制细胞凋亡，最终促进肿瘤发展[7]。Li等[8]的研究指出Hh信号通路可调控卵巢癌细胞的生物学特性；Nitzki等[9]发现在横纹肌肉瘤中存在Ptch的过表达；Dong等[10]则认为Gli1的激活是埃洛替尼耐药在人非小细胞肺癌中的关键机制。研究发现，在人前列腺癌细胞中，Hh信号处于高度活跃状态[11]。Hh在前列腺癌中的异常激活，说明其通路相关蛋白或与前列腺癌发生发展具有相关性。

本文通过对前列腺癌组织样本进行分析，探究Hh信号通路关键蛋白表达和前列腺癌发病及预后的关系，验证Hh相关蛋白是否能作为前列腺癌肿瘤标志物，从而帮助疾病的诊断和治疗。本文研究发现，Hh信号通路相关蛋白(Shh、Ptch和Gli1)过表达与前列腺癌疾病的严重程度密切相关，经Kaplan-Meier生存分析，Hh信号通路相关蛋白表达较高的前列腺癌患者无进展生存时间短，本文研究结果证明Hh信号通路激活对前列腺癌患者具有不良影响，为后续前列腺癌的靶向治疗提供新思路。Hh信号传递是通过靶细胞膜上的受体Ptch及Smo作用于核转录因子Gli1,从而引起靶基因的表达,发挥其生理作用。Hh激活不仅能作为前列腺癌预后不良指标，也是疾病的潜在治疗靶点。目前，Hh信号通路抑制剂，如vismodegib和sonidegib，已被开发用于癌症治疗，特别是对难治性/晚期癌症患者[12]。其中，Ross等[13]验证了sonidegib在前列腺癌中的疗效；此外，Hh信号通路抑制剂联合化疗或放疗手段，也能有效提高前列腺肿瘤的体内外治疗效果[14]。

综上所述，本研究验证了Hh信号通路激活及其相关蛋白高表达与前列腺癌患者不良预后紧密相关，Shh、Ptch和Gli1的表达能反应疾病的严重程度，从而作为前列腺癌患者不良预后的生物指标。