血浆环状RNA hsa_circ_0004812在HBV相关性肝癌中的诊断价值

郭 靓， 赵 鑫， 强雪芹

(成都市第七人民医院检验科，四川省成都市610213)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是中国常见消化道恶性肿瘤，在癌症致死病因中排第二位[1]。慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是导致肝纤维化、肝硬化和肝癌的主要原因之一[2]。由于早期肝癌临床症状不明显，且临床常用诊断肝癌的血清生物标志物甲胎蛋白(alpha fetal protein，AFP)和其他潜在血清生物标志物的诊断准确性不高，造成临床上肝癌死亡率居高不下[3]。因此，临床上亟需新的生物标志物来提高肝癌的早期检测水平。

环状RNA(circular RNA，circRNA)是由反向剪接形成、具有共价闭环结构的一种单链RNA分子，大部分由外显子反向剪接形成，少部分直接来自内含子环化。circRNA作为一种新的内源性非编码RNA，已被证实在机体多种细胞内表达并能调节不同生理代谢过程，包括细胞生长和信号转导[4]。此外，最新报道发现circRNA与多种不同疾病有关，且被认为是一种潜在的用于肺癌、乳腺癌、胃癌和肝癌等多种癌症诊断的新生物标志物[5-6]。因此，本研究旨在分析一个ID：hsa_circ_0004812(CircBase数据库)的circRNA，作为一种潜在生物标志物，在HBV相关性肝癌中的诊断意义。

1 资料和方法

1.1 资料来源

选择2018年8月—2019年10月在本院就诊HBV相关性肝癌患者108例(肝癌组)、慢性乙型肝炎患者97例(肝炎组)、乙型肝炎肝硬化患者92例(肝硬化组)，设同期健康志愿者101例为正常对照组。肝癌组、肝炎组、肝硬化组间一般资料差异无显著性(P>0.05)，具有可比性。该研究经过本院伦理审查委员会批准，并获得所有参与者的知情同意。

纳入标准：①年龄18～80岁，②病情未严重至进入重症监护病房。正常对照组：①无HBV感染，②健康且无恶性肿瘤。慢性乙型肝炎：①有HBV感染，②无其他恶性肿瘤。乙型肝炎肝硬化：①有乙型肝炎病毒感染，②肝活检确诊，或诊断必须有两份图像报告(B超、计算机断层扫描或磁共振成像)支持诊断为肝硬化。HBV相关性肝癌：①有HBV感染，②病理确诊为肝癌，③术前无化疗、放疗、经动脉化疗栓塞或消融治疗。

1.2 实验室指标检测

上午空腹状态下抽取静脉血，3 000 r/min离心，分离出血浆样本后于-80 ℃保存待测。采用东芝80型全自动生物化学分析仪测定总胆红素(TBil)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)、碱性磷酸酶(ALP)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)等肝功能生物化学指标，采用电化学发光法(ECLIA)测定甲胎蛋白(alpha fetal protein，AFP)水平，所有步骤均严格按照操作流程进行。

1.3 总RNA提取

血浆样本根据试剂说明书以TRIzolTMLS Reagent(ThermoFisher)提取样本总RNA样本。在异丙醇沉淀过程中，添加糖原(Ambion/Applied Biosystems，美国)作为共沉淀物(最终质量浓度为100 mg/L)以增强RNA沉淀。RNA样品的纯度和质量浓度由NanoDrop ND-1000(NanoDrop Technologies，美国)测定。RNA完整性通过变性琼脂糖凝胶电泳进行评估。用RNAe R(Epicentre)消化每个样品中的总RNA，去除线性RNA并富集circRNA。

1.4 实时定量PCR检测hsa_circ_0004812表达

按照生产商反转录试剂盒说明书的操作步骤，以M-MLV反转录试剂盒(Thermo112Fisher)将血浆样本中提取的总RNA样本进行反转录。按照SYBR®Premix Ex-TaqTMII(Tli RNAeH Plus)和ROX Plus(Takara，日本)的试剂说明进行操作，在StepOneTM实时定量PCR系统(Applied Biosystems，USA)上进行qRT-PCR。hsa_circ_0004812正向引物:5′-GCC TGC TAC CAC CA-3′,反向引物:5′-TTG TCA CGC TCC CT-3′；内参U6正向引物:5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′,反向引物:5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。以实时PCR的熔化曲线来评定其准确性。用2-△△Ct法计算各基因表达。靶基因的mRNA表达值以U6的mRNA表达值为标准进行相对定量。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 各组一般资料的比较

肝癌组、肝炎组和肝硬化组TBil、γ-GT、ALP、ALT、AST以及AFP水平与正常对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05；表1)。

表1 各组间一般资料的比较

2.2 各组hsa_circ_0004812表达水平的比较

HBV相关性肝癌患者hsa_circ_0004812表达明显高于正常对照组、肝炎组和肝硬化组(P<0.05；图1)。

图1 qRT-PCR检测各组hsa_circ_0004812表达水平a为P<0.05，与正常对照组、肝炎组或肝硬化组比较。

2.3 血浆hsa_circ_0004812和甲胎蛋白诊断价值的比较

以hsa_circ_0004812和AFP为检验变量，分别以正常对照组、肝炎组以及肝硬化组作为状态标量，以灵敏度为Y轴,以“1-特异度”为X轴分别绘制ROC曲线(图2)。结果表明，hsa_circ_0004812和AFP联合检测灵敏度显著高于各指标单独检测(P<0.05),且联合诊断的AUC显著高于各项指标单独检测(P<0.05),联合诊断时，任一指标为阳性，即可诊断为HBV相关性肝癌(表2)。

表2 hsa_circ_0004812、AFP单独及联合检测肝癌诊断价值的比较

图2 AFP和hsa_circ_0004812的ROC曲线分析

3 讨 论

在中国，大多数肝癌患者都存在乙型肝炎病毒相关的肝炎史，并引起机体内肝细胞的持续炎症反应、肝细胞坏死和结节性再生等病理特征的长期反复出现[7]。而炎症和肝硬化的同时存在造成肝癌的早期诊断更加困难，主要是由于HBV感染引起的肝细胞炎症和肝细胞再生释放了大量的细胞因子和生物标志物，其中就包括circRNA。研究表明，机体受到病毒感染后宿主细胞以及病毒产生大量circRNA，从而存在作为病毒感染的候选生物标志物的潜在可能性[8]。同时，circRNA还参与机体调节抗病毒免疫应答、病毒复制以及传染病的发病机制[9]。因此，本研究将HBV相关性肝癌与HBV相关性肝硬化以及慢性乙型肝炎进行比较，以筛选出与HBV相关性肝癌高特异性的circRNA，从而排除肝硬化和慢性乙型肝炎中的异常circRNA。

与线性RNA不同，具有特殊环状闭合结构的circRNA对核糖核酸酶不敏感，相比线性RNA更稳定。且有研究发现，circRNA在人体内的外泌体、唾液和外周血中广泛富集,这使得circRNA作为一种很有前途的疾病分子标记尤其具有吸引力[10]。研究表明，circRNA在慢性乙型肝炎引起肝癌的发生和发展中起着重要作用[11]。Wong等[12]的研究已经证明了HBV circRNA在HBV患者的肝脏中异常高表达，占主导地位。Wang等[13]通过Meta分析报道了HBV相关性肝癌中circRNA的差异表达，并确定hsa_circ_101764可能在肝癌中起重要作用。最新报道发现，Yu等[14]通过应用微阵列技术和qPCR技术对HBV相关性肝癌患者血浆circRNA进行检测，探讨血浆circRNA是否能诊断HBV相关性肝癌，结果发现一种血浆circRNA组合(CircPanel，包括hsa_circ_0000976、hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897)，在区分肝癌与健康人群、乙型肝炎及肝硬化患者时，显示出比临床使用的血清生物标志物AFP更高的准确性，并且在诊断AFP阴性肝癌中表现良好。总之，这些研究结果提示血浆circRNA是一种慢性乙型肝炎发展过程中潜在的肝癌诊断生物标志物。

2018年，Zhou等[15]通过对慢性乙型肝炎患者肝组织中circRNA的差异表达谱进行分析。结果发现，与正常对照组相比，hsa_circ_0004812是慢性乙型肝炎中显著上调的前十个circRNA之一。而巧合的是，最近Zhang等[16]研究表明hsa_circ_0004812在慢性乙型肝炎患者和乙肝病毒感染的肝癌细胞系中均表达上调，且进一步研究表明hsa_circ_0004812能通过海绵吸附抑制miR-1287-5p促进卵泡抑素相关蛋白1(FSTL1)表达，从而影响HBV诱导的免疫抑制。众所周知，microRNA与恶性肿瘤的发生发展密切相关[17]，而多项研究已证明miR-1287-5p在包括胰腺癌、结直肠癌和乳腺癌等多种癌症中作为抑癌因子发挥重要调控作用[18-20]。亦有研究表明，FSTL1作为促癌因子，能通过Akt/GSK-3β依赖的方式抑制细胞凋亡促进肝癌进展[21]。因此，有理由相信，肝癌细胞中可能存在hsa_circ_0004812/miR-1287-5p/FSTL1轴调控HBV诱导的免疫抑制，最终影响HBV相关性肝癌的进展。目前已有报道认为，circRNA可以通过海绵吸附抑制microRNA，或与RNA蛋白结合海绵吸附形成支架，从而调节原癌基因和/或抗癌基因表达，进而影响肿瘤的发生、发展[22]。有研究报道显示，circular RNASMA-RCA5可能充当miR-17-3p和miR-181b-5p的吸附海绵，从而影响肝癌的凋亡、增殖、侵袭与迁移[23]。

本研究通过分析临床资料及qRT-PCR实验检测血浆circRNA表达，证实了血浆circRNA(hsa_circ_0004812)在HBV相关性肝癌中的诊断意义。本研究结果表明，通过检测血浆hsa_circ_0004812水平可以将肝癌与健康人群以及HBV相关肝炎、肝硬化患者区分开来。有研究通过利用miRanda中构建的miRNA靶向预测软件和RNAhybrid数据库，预测了hsa_circ_0004812与其靶向miRNA之间的相互作用[15]，提示circRNA可能通过调节microRNA或作为microRNA载体参与肿瘤的各种生物学过程。

目前，AFP被广泛用于肝癌的诊断和监测[24]。因此，本文比较了hsa_circ_0004812与AFP对HBV相关肝癌的诊断意义。ROC曲线分析显示AFP诊断准确率略高于hsa_circ_0004812。hsa_circ_0004812与AFP联合诊断应用对肝癌患者有较好的鉴别能力。本研究结果提示血浆hsa_circ_0004812是诊断HBV相关性肝癌的一个潜在的标志物。

综上所述，本研究发现血浆circRNA hsa_circ_0004812，可以区分HBV相关性肝癌与HBV肝炎、肝硬化和健康人群，其诊断性能与AFP相当，联合检测价值更高。hsa_circ_0004812可作为诊断HBV相关性肝癌的新标志物。另外，本研究仍存在一定的局限性。包括招募的HBV相关性肝癌患者样本过少，需要更大规模和多中心的研究来证实。其次对肝癌患者中circRNA的内源性调控机制尚无探究，需要进一步的研究来确定circRNA的内部调控机制。