血浆细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制因子、环腺苷酸反应元件结合蛋白水平与糖尿病视网膜病变关系研究

胡绍波，李珊，邹毅，孙文忠，张文君

糖尿病是中国常见慢性疾病，是世界范围重大公共健康问题，发病率达11.6%，其发生可累及多个器官，其中，微血管是糖尿病主要累及器官之一［1］。当微血管产生病变累及视网膜时，会导致糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）发生。DR是最主要的致盲眼病，其致盲率较其他疾病高11倍，起病隐匿，出现后则难以遏制病程进展［2］。其发病主要与血管内皮损伤、凝血机制异常等有关，炎性因子、生长因子、细胞凋亡等多种分子及信号通路参与调控［3］。细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制因子（P15INK4b）在细胞周期调控中起关键作用，在干细胞分化、凋亡过程中起调控作用［4］。环腺苷酸反应元件结合蛋白（CREB）是核转录调节因子，与机体造血过程、细胞存活、增殖关系密切，对细胞凋亡有抑制作用［5］。目前，P15INK4b、CREB在DR发生发展中的作用尚未有人研究。本研究通过检测P15INK4b、CREB在DR病人血浆中的表达水平，研究其与DR发生发展的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2017年6月至2019年6月在仙桃市第一人民医院收治的糖尿病病人（观察组）198例作为研究对象；根据是否患有DR，将糖尿病病人分为非DR组（95例）和DR组（103例）；根据病变阶段将DR病人分为非增生性糖尿病视网膜病变（NPDR）Ⅰ期组（24例）、NPDRⅡ期组（29例）、NPDRⅢ期组（26例）和增生性糖尿病性视网膜病变（PDR）组（24例）；选取同期健康体检者（对照组）200例作为对照。收集各组一般资料，包括：性别、年龄、体质量、体质量指数（BMI）。

纳入标准：（1）糖尿病诊断符合2010年糖尿病治疗指南［6］，DR诊断及分型符合《我国DR临床诊疗指南（2014）年》［7］。（2）病人及近亲属知情并签署知情同意书。（3）经仙桃市第一人民医院伦理委员会审核批准（批号1704-3）。排除标准：（1）患有感染性疾病、免疫性疾病、精神疾病、心脑血管疾病、恶性肿瘤、肝肾功能异常者。（2）并发青光眼等其他眼部疾病者。（3）有中枢或外周神经疾病史、DR治疗史病人。（4）妊娠或哺乳期妇女。（5）近期或正在服用影响血浆P15INK4b、CREB、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、转化生长因子β1（TGF-β1）、血管内皮生长因子（VEGF）表达水平者。（6）依从性较差，未按规定进行检查。（7）近1个月内参与过其他临床试验者。（8）资料不全者。

1.2 试剂与仪器所用蛋白质免疫印迹（Western blotting）检测试剂盒（货号ZD320）购自上海经科化学科技有限公司；所用人TNF-α、TGF-β1、VEGF酶联免疫（ELISA）吸附法试剂盒（货号分别为HL10038、HL10095、HL10094）均购自上海哈灵生物科技有限公司；酶标仪（型号MODEL550）购自美国Bio-Rad公司。

1.3 样本采集及指标检测各组清晨采集空腹外周静脉血2份，1份EDTA-K2抗凝，3 000 r∕min离心15 min，吸取血浆于1.5 mL EP管中，-20℃保存，用于P15INK4b、CREB水平检测；1份4℃低温3 000 r∕min离心10 min，吸取上层血清0.5 mL于无菌EP管中，用于TNF-α、TGF-β1、VEGF水平检测。

Western blotting检测血浆P15INK4b、CREB和ELISA法检测血清TNF-α、TGF-β1、VEGF的试验方法，均按照试剂盒说明书进行，P15INK4b、CREB蛋白相对表达量以P15INK4b、CREB蛋白条带与内参照GADPH条带灰度值比值表示。酶标仪测定吸光度值，波长为450 nm，重复3次，计算平均值，根据标准液吸光度结果与标准液浓度绘制标准曲线，得出换算方程，计算TNF-α、TGF-β1、VEGF表达水平。

1.4 统计学方法利用统计学软件SPSS 24.0进行统计分析。计量资料均采用±s进行描述，四组行单因素方差分析，两两比较比较行LSD-t检验。计数资料均以例（%）表示，组间比较行χ2检验。Pearson法分析DR病人血浆P15INK4b、CREB水平与血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平的相关性。以糖尿病病人是否患DR作为因变量，将单因素方差分析有明显差异的指标为自变量建立logistic回归模型，Waldχ2检验回归参数估计值，似然比检验模型拟合情况。当P＜0.05时，差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较两组性别、年龄、体质量、BMI比较，均差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 糖尿病病人198例及健康体检者200例一般资料比较

2.2 两组血浆P15INK4b、CREB水平与对照组相比，观察组血浆P15INK4b、CREB水平明显升高（P＜0.05）。见表2。

表2 糖尿病病人198例及健康体检者200例血浆P15INK4b、CREB水平比较/±s

表2 糖尿病病人198例及健康体检者200例血浆P15INK4b、CREB水平比较/±s

注：P15INK4b为细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制因子，CREB为环腺苷酸反应元件结合蛋白。

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2.3 两组血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平与对照组相比，观察组血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平明显升高（P＜0.05）。见表3。

表3 糖尿病病人198例及健康体检者200例血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平比较/±s

表3 糖尿病病人198例及健康体检者200例血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平比较/±s

注：TNF-α肿瘤坏死因子-α，TGF-β1转化生长因子β1，VEGF血管内皮生长因子。

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2.4 糖尿病各组血浆P15INK4b、CREB、血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平与非DR组相比，DR组血 浆P15INK4b、CREB、血 清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平明显升高（P＜0.05）。见表4。

表4 糖尿病病人198例血浆P15INK4b、CREB、血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平比较∕±s

表4 糖尿病病人198例血浆P15INK4b、CREB、血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平比较∕±s

注：P15INK4b为细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制因子，CREB为环腺苷酸反应元件结合蛋白，TNF-α为肿瘤坏死因子-α，TGF-β1为转化生长因子β1，VEGF为血管内皮生长因子。

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2.5 DR病人各组血浆P15INK4b、CREB水平与NPDRⅠ期组相比，NPDRⅡ期、NPDRⅢ期、PDR组DR病人血浆P15INK4b、CREB水平明显升高（P＜0.05）；与NPDRⅡ期组相比，NPDRⅢ期、PDR组DR病人血浆P15INK4b、CREB水平明显升高（P＜0.05）；与NPDRⅢ期组相比，PDR组DR病人血浆P15INK4b、CREB水平明显升高（P＜0.05）。见表5。

表5 糖尿病视网膜病变（DR）103例血浆P15INK4b、CREB水平比较/±s

表5 糖尿病视网膜病变（DR）103例血浆P15INK4b、CREB水平比较/±s

注：P15INK4b为细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制因子，CREB为环腺苷酸反应元件结合蛋白，NPDR为非增生性糖尿病视网膜病变。①与NPDRⅠ期组相比，P＜0.05。②与NPDRⅡ期组相比，P＜0.05。③与NPDRⅢ期组相比，P＜0.05。

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2.6 DR病人各组血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平与NPDRⅠ期组相比，NPDRⅡ期、NPDRⅢ期、PDR组DR病人血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平明显升高（P＜0.05）；与NPDRⅡ期组相比，NPDRⅢ期、PDR组DR病人血清TNF-α、TGF-β1、VEGF表达水平明显升高（P＜0.05）；与NPDRⅢ期组相比，PDR组DR病人血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平明显升高（P＜0.05）。见表6。

表6 糖尿病视网膜病变（DR）103例血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平比较/±s

表6 糖尿病视网膜病变（DR）103例血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平比较/±s

注：TNF-α为肿瘤坏死因子-α，TGF-β1为转化生长因子β1，VEGF为血管内皮生长因子，NPDR为非增生性糖尿病视网膜病变。①与NPDRⅠ期组相比，P＜0.05。②与NPDRⅡ期组相比，P＜0.05。③与NPDRⅢ期组相比，P＜0.05。

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2.7 DR病人血浆P15INK4b、CREB水平与血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平相关性相关性分析结果显示，DR病人血浆P15INK4b、CREB水平与血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平均明显正相关（P＜0.05）。见表7。

表7 DR病人血浆P15INK4b、CREB水平与血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平的相关性分析

2.8 影响DR发生的多因素分析将糖尿病病人是否患DR作为因变量，以血浆P15INK4b、CREB水平、血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平为自变量进行多因素logistic回归分析，结果显示血浆P15INK4b、CREB、血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平均是影响DR发生的危险因素（P＜0.05）。见表8。

表8 影响DR发生的多因素分析

3 讨论

如今，中国糖尿病患病人数高居全球第一，患病率达全球第二［8］。长期高血糖症状易引起并发症，其中，DR是糖尿病病人常见微血管并发症，是微动脉瘤形成、毛细血管灌注缺乏、视网膜局部缺血等原因，最终导致新生血管形成疾病［9］。研究表明，糖尿病病人病程为5～10年时，并发DR比率达50.0%～56.7%，在中国并发DR糖尿病病人占总糖尿病病人的37.2%～51.3%，当DR病人发病阶段演变为PDR，即产生新生血管时，致盲率可高达23.6%，是50岁以上人群致盲主要原因，给糖尿病病人及家庭造成严重经济负担及精神压力［10-11］。因此，研究DR发病及病情演变过程中的影响因素，对控制病人病情进展有重要意义。

P15INK4b常被当做肿瘤抑制因子，近年来被发现在糖尿病上也发挥作用。钟凌等［12］研究表明，P15INK4b联合miR-451a在糖尿病肾病的肾纤维化过程发挥作用，认为P15INK4b可通过调节细胞周期影响肾组织损害。CREB是一种基础转录因子，活化后参与血管内皮细胞形成，诱导血管内皮细胞通透性增加，调控炎症反应，在许多血管屏障破坏的疾病中发挥作用［13-15］。徐秀娟等［16］发现CREB参与大鼠的肺微血管内皮细胞的炎症损伤过程。郑转珍等［17］发现CREB可通过参与机体的造血过程参与调控急性白血病的发生发展。P15INK4b、CREB分别与糖尿病、微血管内皮细胞调控有关，推测可能在糖尿病微血管并发症上也发挥作用。

本研究结果表明，与对照组相比，观察组血浆P15INK4b、CREB、血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平明显升高，提示P15INK4b、CREB、TNF-α、TGF-β1、VEGF参与糖尿病发生过程。与非DR组相比，DR组病人血浆P15INK4b、CREB、血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平明显升高，且随着病变阶段的升级，DR病人血浆P15INK4b、CREB、血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平明显升高；提示P15INK4b、CREB、TNFα、TGF-β1、VEGF参与调控DR的发生发展过程。DR病人血浆P15INK4b、CREB水平与血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平均明显正相关，提示P15INK4b、CREB可能通过调控血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平参与DR发生发展过程。血浆P15INK4b、CREB、血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平均是影响DR发生的危险因素，提示血浆P15INK4b、CREB、血清TNFα、TGF-β1、VEGF水平升高可能影响DR发生。

综上所述，DR病人血浆P15INK4b、CREB水平上调，且随着病情演变阶段的升高而严重异常表达，可能通过调控血清TNF-α、TGF-β1、VEGF水平参与疾病的发生发展。但本研究存在不足，可进一步研究血浆P15INK4b、CREB的mRNA表达情况，及血浆P15INK4b、CREB水平对DR的诊断价值。