微小RNA-195降低寡聚态β样淀粉蛋白1-42诱导大鼠肾上腺嗜铬细胞炎症反应和凋亡作用机制

李鑫，孙茂苍，崔山龙

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是老年人痴呆症的最常见原因，是一种进行性神经退行性疾病，逐渐夺走病人的认知功能并最终导致死亡［1］。AD每年的新发病量逐年上升。AD神经病理学的特征在于β样淀粉蛋白（Aβ）的细胞外积累。随着疾病的进展，肉眼可见的萎缩影响新皮质的内嗅区和海马区，杏仁核和关联区域蓝斑的位置被淡化［2］。Aβ的沉积首先由漫射沉积物制成，淀粉样蛋白聚焦沉积物构成老年斑的核心［3］。在新皮质、海马、纹状体、中脑以及最后的小脑以及脑桥核（Thal相）中连续发现Aβ沉积物［4］。家族性病例表明Aβ沉积是最初的症状［5］。miRNA是短链内源性RNA，其表达异常可影响靶基因的转录和翻译进而参与人类多种疾病进展，其中包括AD［6-8］。微小RNA-195（miR-195）虽已有报道在AD中的研究，遗憾的是，其发挥作用的调控机制与ATP酶阳离子转运13A2（ATP13A2）的关系尚未有人报道。ATP13A2是遗传性青少年AD的致病基因［9］，其在AD中的功能尚未有人研究。本研究在2018年3—11月开展实验，拟以Aβ1-42诱导大鼠肾上腺嗜铬细胞（PC12细胞）损伤模型为研究对象，探讨过表达miR-195、沉默ATP13A2、过表达ATP13A2对Aβ1-42诱导PC12细胞炎性因子分泌以及细胞增殖和凋亡的影响，揭示miR-195和ATP13A2的靶向关系，以期为AD治疗提供新方向。

1 材料与方法

1.1 材料PC12细胞购自美国模式培养物保藏中心；Aβ1-42购自日本和光；杜尔伯格氏伊戈尔（DMEM）培养基购自Gibco；胎牛血清购自杭州四季青；噻唑蓝（MTT）细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自科联生物；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒、LipofectamineTM2000、逆转录试剂盒购自大连Takara公司；双荧光素酶基因检测试剂盒、ECL发光液均购自碧云天生物技术公司；半干转膜仪购自美国BIORAD公司；PCR仪购自美国BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养PC12细胞用DMEM培养基（含10%胎牛血清）在细胞培养箱中进行常规培养。

1.2.2细胞转染与分组将正常培养的PC12细胞标记为对照（Control）组。按照吴明等［10］的方法用25 μmol∕mL的Aβ1-42处理PC12细胞48 h，标记为Aβ组。将PC12细胞分为Aβ1-42+miR-con组、Aβ1-42+miR-195组、Aβ1-42+si-con组、Aβ1-42+ATP13A2小干扰RNA（si-ATP13A2）组、miR-con组、miR-195组、miR-195+pcDNA组、miR-195+ATP13A2过表达质粒（pcDNA-ATP13A2）组，用脂质体LipofectamineTM2000试剂盒将寡核苷酸或质粒转染至PC12细胞，转染6 h后，更换新鲜培养基培养48 h，部分组用25 μmol∕mL的Aβ1-42处理，用实时定量PCR（qRT-PCR）法检测转染效果。转染成功后，进行下一步实验。

1.2.3qRT-PCR实验检测细胞中miR-195、ATP13A2的mRNA的表达Trizol法提取细胞总RNA，并用DNaseⅠ消化以除去可能污染的DNA。逆转录合成模板链cDNA，随后制备20 μL扩增体系进行qRT-PCR，重复3次，取平均值，分析Ct值，以2-ΔΔCt法计算miR-195、ATP13A2的相对表达水平。引物信息：miR-195（正向引物ACGATGCCCACGACCAAGCC；反向引物TAGCAGCACAGAAATATTGGC）；ATP13A2（正向引物5′-ATGGTGACAGGGGACAACCT-3′；反向引物5′-ACTTGAAGACGCTGAATGAAG-3′）。

1.2.4Western blotting检测细胞中ATP13A2的蛋白表达RIPA法提取蛋白后，以4∶1的比例加入蛋白上样缓冲液，混匀，沸水浴变性5 min。取60 μg蛋白进行SDS-PAGE，转移PVDF膜后，加入2.5%脱脂奶粉来阻断非特异性结合。将PVDF膜放入1∶1 000稀释一抗中4℃反应过夜，再将PVDF膜转入1∶2 000稀释的二抗中37℃反应2 h。于暗室内滴加化学发光剂显影，凝胶成像系统采集图像。以Qμantity One 4.62软件测定的目的条带和β-actin条带灰度比值表示蛋白表达。

1.2.5ELISA实验检测细胞中白细胞介素1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）的含量人IL-1β、TNF-α检测试剂盒用来检测细胞中IL-1β、TNF-α的含量。

1.2.6MTT实验检测细胞的增殖将1.2.2各组细胞制成调整至104个∕毫升单细胞悬液，然后接种至96孔板，每孔加MTT溶液（5 mg∕mL）20 μL，孵育4 h，终止培养，弃去上清，每孔加150 μL DMSO，振荡融解结晶，在490 nm波长下检测细胞吸光度（A）以表示细胞增殖活性。

1.2.7流式细胞术检测细胞的凋亡用500 μL的结合缓冲液悬浮1.2.2各组细胞，分别加入5 μL Annexin V-∕FITC、5 μL碘化丙啶避光反应20 min，1 h内上流式细胞仪检测。细胞凋亡率（%）以早期凋亡率和晚期凋亡率之和表示。

1.2.8双荧光素酶报告基因检测实验检测细胞中miR-195与ATP13A2的 表 达野 生 型∕突 变 型ATP13A2载体由上海吉玛公司提供。将野生型∕突变型ATP13A2载体分别与miR-195、miR-con共转染，24 h后检测荧光强度。海参荧光素酶荧光强度与萤火虫荧光素酶荧光强度的比值即反应miR-195与ATP13A2的结合力。

1.2.9统计学方法实验数据以±s表示，每组数据代表3个平行实验复孔，每个实验重复3次。采用PEMS 3.2进行分析，用Shapiro-Wilk检验分析数据正态性，用Levene检验分析方差齐性。完全随机设计的两组均数的比较采用成组设计t检验；多组均数的比较采用单因素方差分析，其中两两比较采用SNK-q法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 寡聚态Aβ1-42诱导的PC12细胞影响miR-195和ATP13A2的表达与Control组相比，Aβ1-42组PC12细胞中miR-195的表达显著降低（P＜0.001），ATP13A2 mRNA和蛋白表达均显著升高（P＜0.001），见表1，图1。

表1 miR-195和ATP13A2在Aβ诱导的PC12细胞中的表达∕±s

表1 miR-195和ATP13A2在Aβ诱导的PC12细胞中的表达∕±s

注：miR-195为微小RNA-195，ATP13A2为ATP酶阳离子转运13A2，Aβ为β样淀粉蛋白。

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图1 ATP13A2在Aβ1-42诱导的PC12细胞中的表达

2.2过表达miR-195抑制寡聚态Aβ1-42诱导的PC12细胞炎性因子的分泌与Control组相比，Aβ1-42组PC12细胞中miR-195表达显著降低（t=15.79，P＜0.001），IL-1β、TNF-α表达显著升高（t=15.12，P＜0.001；t=21.77，P＜0.001）；与Aβ1-42+miR-con组相比，Aβ1-42+miR-195组PC12细胞IL-1β、TNF-α表达显著降低（t=10.88，P＜0.001；t=8.22，P＜0.001），miR-195表达显著升高（t=44.43，P＜0.001）。见表2。

表2 miR-195过表达对Aβ诱导的PC12细胞炎性因子分泌的影响∕±s

表2 miR-195过表达对Aβ诱导的PC12细胞炎性因子分泌的影响∕±s

注：miR-195为微小RNA-195，Aβ为β样淀粉蛋白，IL-1β为白细胞介素1β，TNF-α为肿瘤坏死因子α。①与Ccontrol组比较，P＜0.05。②与Aβ1-42+miR-con组比较，P＜0.05。

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2.3 过表达miR-195影响寡聚态Aβ1-42诱导的PC12细胞存活率和凋亡率与Control组相比，Aβ1-42组PC12细胞的细胞活性显著降低（t=15.70，P＜0.001），细胞凋亡率显著升高（t=20.19，P＜0.001）；与Aβ1-42+miR-con组相比，Aβ1-42+miR-195组PC12细胞的细胞活性显著升高（t=8.41，P＜0.001），细胞凋亡率显著降低（t=8.80，P＜0.001）。见表3，图2。

图2 miR-195过表达对Aβ1-42诱导的PC12细胞凋亡率的影响

表3 miR-195过表达对Aβ诱导的PC12细胞存活率和凋亡率的影响∕（%，±s）

表3 miR-195过表达对Aβ诱导的PC12细胞存活率和凋亡率的影响∕（%，±s）

注：①与Control组比较，P＜0.05。②与Aβ1-42+miR-con组比较，P＜0.05。

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2.4 miR-195靶向调控ATP13A2miRcode数据库预测显示miR-195与ATP13A2 3′UTR存在互补核苷酸序列，见图3A；野生型ATP13A2和miR-195共转染组细胞的相对荧光活性显著低于野生型ATP13A2和miR-NC共转染组（t=10.61，P＜0.001），突变型ATP13A2和miR-195共转染组细胞的相对荧光活性与突变型ATP13A2和miR-NC共转染组比较差异无统计学意义（t=1.26，P=0.216），见表4；miR-195组细胞中ATP13A2蛋白水平（0.18±0.03）显著低于miR-NC组（0.39±0.04），t=9.78，P＜0.001，anti-miR-195组细胞中ATP13A蛋白水平（0.70±0.07）显著高于anti-miR-NC组（0.42±0.03），t=13.04，P＜0.001。四组比较，F=197.89，P＜0.001，见图3B。

图3 miR-195靶向ATP13A2：A为miR-195与ATP13A2的3’UTR之间存在互补的核苷酸序列；B为miR-195负向调控ATP13A2的蛋白表达

表4 双荧光素酶报告实验∕±s

表4 双荧光素酶报告实验∕±s

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2.5 沉默ATP13A2影响寡聚态Aβ1-42诱导的PC12细胞炎性因子分泌以及细胞存活和凋亡相较于Control组，Aβ1-42组PC12细胞中ATP13A2蛋白水平显著升高（t=10.64，P＜0.001），IL-1β、TNF-α的含量显著升高（t=17.03，P＜0.001；t=20.119，P＜0.001），细胞活性显著降低（t=15.27，P＜0.001），细胞凋亡率显著升高（t=21.34，P＜0.001）；与Aβ1-42+si-con组相比，Aβ1-42+si-ATP13A2组PC12细胞中ATP13A2蛋白表达显著降低（t=7.39，P＜0.001），IL-1β、TNF-α的含量显著降低（t=11.42，P＜0.001；t=10.22，P＜0.001），细胞活性显著升高（t=8.07，P＜0.001），细胞凋亡率显著降低（t=7.01，P＜0.001）。见图4，表5。

表5 抑制ATP13A2影响寡聚态Aβ诱导的PC12细胞炎性因子的分泌、细胞存活和细胞凋亡∕±s

表5 抑制ATP13A2影响寡聚态Aβ诱导的PC12细胞炎性因子的分泌、细胞存活和细胞凋亡∕±s

注：Aβ为β样淀粉蛋白，IL-1β为白细胞介素1β，TNF-α为肿瘤坏死因子α。①与Control组比较，P＜0.05。②与Aβ1-42+si-con组比较，P＜0.05。

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图4 抑制ATP13A2的寡聚态Aβ1-42诱导的PC12细胞

2.6 过表达miR-195和过表达ATP13A2对寡聚态Aβ1-42诱导的PC12细胞炎性因子的分泌和细胞凋亡的影响相较于Aβ1-42+miR-con组，Aβ1-42+miR-195组PC12细胞中ATP13A2蛋白水平显著降低（t=11.26，P＜0.001），IL-1β、TNF-α的含量显著降低（t=14.66，P＜0.001；t=9.676，P＜0.001），细胞活性显著升高（t=9.44，P＜0.001），细胞凋亡率显著降低（t=21.34，P＜0.001）；与Aβ1-42+miR-195+pcDNA组相比，Aβ1-42+miR-195+pcDNA-ATP13A2组PC12细胞中ATP13A2蛋白表达显著升高（t=6.43，P＜0.001），IL-1β、TNF-α的含量显著升高（t=7.22，P＜0.001；t=6.271，P＜0.001），细胞活性显著降低（t=6.37，P＜0.001），细胞凋亡率显著升高（t=7.01，P＜0.001）。见表6，图5。

表6 过表达miR-195和过表达ATP13A2对寡聚态Aβ诱导的PC12细胞炎性因子的分泌、细胞存活和细胞凋亡的影响∕±s

表6 过表达miR-195和过表达ATP13A2对寡聚态Aβ诱导的PC12细胞炎性因子的分泌、细胞存活和细胞凋亡的影响∕±s

注：Aβ为β样淀粉蛋白，IL-1β为白细胞介素1β，TNF-α为肿瘤坏死因子α。①与Aβ1-42+miR-con组比较，P＜0.05。②与Aβ1-42+miR-195+pcDNA组比较，P＜0.05。

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图5 过表达miR-195和过表达ATP13A2的寡聚态Aβ1-42诱导的PC12细胞中ATP13A2的表达

3 讨论

miRNA在人类的多种疾病中均具有重要作用，其中包括阿尔茨海默病。鲍晨曦等［11］发现，miR-195是精神分裂症病人中差异表达的miRNA之一，我们推测miR-195可能与精神损伤的发病具有一定的相关性。Zhu等［12］在研究中报道，miR-195可降低了β-分泌酶（BACE1）的表达水平，并且miR-195的抑制可导致BACE1蛋白水平的增加，此外，在N2a∕APP中过表达miR-195降低了Aβ的水平，而miR-195的抑制导致Aβ的增加，揭示了miR-195可通过抑制BACE1的翻译来下调Aβ的水平，提示miR-195可能为阿尔茨海默病提供治疗策略，推测miR-195在阿尔茨海默病中低表达。瞿准等［13］在创伤性脑损伤的研究中报道，miR-195的表达异常升高，抑制miR-195的表达改善脑损伤病人神经功能，这为靶向miRNA治疗临床创伤性脑损伤提供了理论依据。本研究通过qRT-PCR法检测到Aβ1-42诱导的PC12细胞损伤中miR-195表达水平明显降低，这与Zhu等［12］的研究结果相一致；此外，过表达miR-195可抑制Aβ1-42诱导的PC12细胞中IL-1β、TNF-α的表达，说明过表达miR-195对阿尔茨海默病具有抗炎的功能，除此之外，细胞存活率明显升高，细胞凋亡率明显降低，揭示过表达miR-195对阿尔茨海默病细胞具有促进增殖，抗凋亡作用，提示miR-195在阿尔茨海默病治疗中的潜在价值；深入研究发现miR-195靶向负调控ATP13A2表达，这为miR-195在阿尔茨海默病中的机制探索提供参考。

由于生物医疗技术的不断发展，越来越多的研究者报道，遗传性因素在PD的产生和发展中的重要作用。目前研究中与PD相关的较热门的基因有ATP13A2、Parkin、LRRK2、PARK16等。大量研究报道，ATP13A2在帕金森病的发生发展中具有重要作用［14-17］。但ATP13A2在阿尔茨海默病中的作用及调控机制报道鲜少。据报道，ATP13A2可作为miR-199a的靶基因参与6-OHDA诱导的PC12细胞的氧化应激过程［18］。miR-4306靶向ATP13A2参与了锰暴露引起的神经退行性变的调控［19］。本研究通过qRT-PCR法、Western blotting法检测Aβ1-42诱导的PC12细胞中ATP13A2的表达发现，ATP13A2的表达水平明显地升高，这与张百平等［18］的实验结果相一致；进一步通过ELISA法、MTT法及流式细胞术检测沉默ATP13A2的Aβ1-42诱导的PC12细胞发现，沉默ATP13A2可下调Aβ1-42诱导的PC12细胞中IL-1β、TNF-α的含量和细胞凋亡，促进增殖，揭示沉默ATP13A2具有与过表达miR-195相同的保护Aβ 1-42诱导的PC12细胞损伤的作用，这是国内外首次发现ATP13A2不仅对帕金森病的进展具有重要作用，其对阿尔茨海默病的炎症、增殖、凋亡过程均具有重要作用。深入研究发现，过表达ATP13A2可逆转miR-195对Aβ1-42诱导的PC12细胞炎性因子分泌、增殖、凋亡的影响，这说明ATP13A2不仅受miR-195的靶向调控，还可逆向反作用miR-195对Aβ1-42诱导的PC12细胞的保护作用，为miR-195在神经退行性疾病中的靶向治疗提供参考依据。

综上所述，miR-195靶向ATP13A2可抑制Aβ1-42诱导的PC12细胞的炎症反应和凋亡。miR-195和ATP13A2可能是治疗阿尔茨海默病的新靶点。