中药海藻及其提取物抗恶性淋巴瘤作用和机制研究进展

顾恪波 何立丽 张丽娜 吴 洁 孙岸弢 张明辉 张 晨

(1.中国中医科学院广安门医院血液科，北京 100053；2.中国中医科学院广安门医院感染疾病科，北京 100053)

中药海藻，为马尾藻科植物海蒿子(大叶海藻)或羊栖菜(小叶海藻)的干燥藻体，《神农本草经》中指出其“味苦寒，主瘿瘤气，颈下核，破散结气，痈肿癥瘕坚气”，《名医别录》谓之“味咸无毒，主治皮间积聚”，《本草拾遗》载其“主结气瘿瘤是也”。因此，海藻在临床上常被用于治疗癥瘕积聚、肿瘤结块[1]，尤其是甲状腺结节和肿瘤[2-3]。现已证实，海藻还可用于恶性淋巴瘤的治疗，但其分子作用机制仍不十分清楚，临床应用受到限制。现将近年来有关海藻及其提取物抗恶性淋巴瘤的作用与机制研究进展综述如下。

1 以海藻为主的方剂对恶性淋巴瘤的作用

在临床研究方面，自上世纪80年代起，即陆续有运用中药海藻抗恶性淋巴瘤的报道[4]。湖南名中医潘敏球先生认为，恶性淋巴瘤多因肝肾阴虚，虚火内动，灼津炼痰，致使痰火凝结而成，以经典方剂“四物汤”合《医学心悟》中的“消瘰丸”加海藻、昆布、黄药子、山慈菇、重楼等共同组成“加减四物消瘰汤(药物

组成：当归、川芎、赤芍、生地黄、玄参、山慈菇、黄药子、海藻、昆布、夏枯草、牡蛎、重楼)”治疗恶性淋巴瘤效果显著[5]。浙江名中医赵树珍先生主张从痰论治恶性淋巴瘤，擅长用海藻、半夏、天南星、夏枯草、山慈菇、牡蛎等化痰软坚散结之品组成治疗基本方，随症加减化裁治疗恶性淋巴瘤取得了较好疗效[6]。孙长勇等[7]以慈菇海藻汤(药物组成：海藻、山慈菇、昆布、黄药子、玄参、夏枯草、当归、川芎、赤芍、生地黄、牡蛎、重楼)配合吉西他滨+地塞米松方案(GDP方案)治疗复发难治性淋巴瘤患者43例，并与单纯GDP方案治疗40例对照。结果显示，观察组缓解率(完全缓解+部分缓解)为93.02%，显著高于对照组(75.00%，P<0.05)；观察组远期复发率为9.30%，远期死亡率为6.98%，均明显低于对照组(27.50%、22.50%，P<0.05)。由此可见，慈菇海藻汤配合GDP方案化疗有较好的增效作用，减少了远期复发，提高了患者长期生存率。

以海藻为君药的经典名方“海藻玉壶汤”，始载于明·陈实功《外科正宗》，由海藻、昆布、海带、贝母、半夏、陈皮、青皮、川芎、当归、连翘、独活、甘草共12味药物组成，是中药“十八反”配伍禁忌“海藻反甘草”的名方，专为瘿瘤类疾病而设，目前动物实验研究证实其对恶性淋巴瘤也有一定抑制作用。如王业生等[8]通过建立胸腺淋巴瘤小鼠模型，以评估海藻玉壶汤对小鼠体内淋巴瘤的作用。结果显示，经海藻玉壶汤治疗后的胸腺淋巴瘤小鼠肿瘤生长明显减缓，其瘤体质量与同期模型对照组小鼠比较显著减轻，肿瘤抑制率高达68.1%；在远期预后评价方面，未经治疗的模型对照组小鼠中位存活时间为11周，而经海藻玉壶汤干预的实验组小鼠中位存活时间为26周，比模型对照组小鼠存活时间显著延长。进一步的机制研究发现，海藻玉壶汤能显著降低肿瘤血流速度和瘤组织的黏度，并降低组织基质金属蛋白酶抑制物-1(TIMP-1)、转化生长因子β1(TGF-β1)、血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的含量，增加瘤组织基质金属蛋白酶9(MMP-9)、MMP-2及与细胞凋亡相关的Fas蛋白含量，抑制成纤维细胞增殖及Ⅰ～Ⅳ型胶原的分泌[9]，提示海藻玉壶汤能阻止恶性淋巴瘤瘤体内的纤维化从而软化瘤体，并能抑制瘤体内新生血管的形成，阻止瘤体内细胞外基质沉积，诱导肿瘤细胞发生凋亡。此外，海藻玉壶汤含药血清还能促进小鼠脾淋巴细胞增殖，提高机体免疫力[9]。

国外研究还显示，海藻不同溶剂提取物对瑞士雄性白化小鼠道尔顿腹水淋巴瘤(Dalton's ascitic lymphoma，DAL)有一定的抑制作用。研究者用海藻的不同溶剂提取物200 mg/kg干预DAL模型小鼠14 d，并与5-氟尿嘧啶20 mg/kg干预进行对照观察。结果显示，与5-氟尿嘧啶组比较，经海藻提取物干预后的DAL模型小鼠肿瘤细胞数量和肿瘤质量显著降低，小鼠寿命明显延长[10]。

2 海藻提取物对恶性淋巴瘤的抑制作用

2.1 诱导恶性淋巴瘤细胞凋亡 褐藻多糖(Fucoidan)是一种从褐藻细胞外基质[11]中分离出来的主要硫酸多糖类成分，在海蒿子[12]和羊栖菜[13]中也均含有。研究表明，Fucoidan可诱导原发性渗出性淋巴瘤(primary effusion lymphoma,PEL)、弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)及人淋巴瘤细胞系HS-Sultan细胞凋亡[14-16]。

PEL是一种罕见的恶性侵袭性B淋巴细胞肿瘤，其发病人群多为老年人或免疫功能低下者，发病与人类疱疹病毒8型感染有关，通常表现为体腔内恶性渗出，却见不到实体瘤块。目前PEL没有很好的治疗方案，大多数患者在一线治疗后6～8个月内复发[17]，1年总生存率仅为30%[18]。研究表明，PEL细胞经2、4 mg/mL浓度的Fucoidan处理后，G1周期细胞的百分比可由未处理的52.1%分别增加到59.6%和69.3%，S周期细胞的百分比可由未处理的30.5%分别下降到22.1%和7.5%[14]，提示Fucoidan可通过诱导PEL细胞在G1周期阻滞，而呈剂量依赖性的抑制PEL细胞增殖。此外，Fucoidan还可通过增强半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-8(caspase-8)及caspase-9的活化，进而激活效应caspase-3而诱导PEL细胞凋亡，却少有严重的毒副作用[14]。

DLBCL是成人最常见的侵袭性B淋巴细胞肿瘤，占非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma，NHL)的40%，占所有淋巴瘤的30%[19]。根据基因表达谱的特点，DLBCL可分为三大类，即生发中心B细胞样DLBCL、活化B细胞样DLBCL和原发性纵隔大B细胞淋巴瘤或未分类的亚型[20-22]。尽管联合化学和免疫治疗可提高DLBCL患者的总体生存率，但有超过30%的患者复发或发展为难治性淋巴瘤[23-25]。研究表明[15]，Fucoidan在体内和体外对DLBCL均有剂量和时间依赖性抑制作用，可引起G0/G1细胞周期阻滞，并可诱导DLBCL细胞凋亡，在此过程中Fucoidan可诱导DLBCL细胞中caspase-8、caspase-9和caspase-3活化，并诱导DNA修复酶多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)蛋白裂解，使细胞线粒体膜电位丧失，细胞色素C和凋亡诱导因子从线粒体释放到细胞质中，从而激活DLBCL细胞凋亡。

对人淋巴瘤细胞系HS-Sultan细胞，Fucoidan同样具有抑制增殖和诱导凋亡的作用。研究发现，经Fucoidan处理24 h后，HS-Sultan细胞线粒体膜电位降低，caspase-3激活，从而通过线粒体途径诱导淋巴瘤细胞凋亡[16]。

2.2 增强蛋白酶体抑制剂的杀伤活性 在真核细胞中，不稳定的或者变性的、错误折叠的蛋白经过泛素活化酶、泛素结合酶、泛素连接酶等共价修饰多聚泛素链后，可被26S蛋白酶体识别并降解[26]。而蛋白酶体抑制剂可阻断这种降解作用，使得这些蛋白在胞内聚集而启动细胞死亡程序。因此，蛋白酶体抑制剂被用于多种肿瘤的治疗。

卡非佐米(CFZ)是26S蛋白酶体不可逆的抑制剂，对多发性骨髓瘤的疗效优于硼替佐米[27]，且对套细胞淋巴瘤和T细胞淋巴瘤也均有一定的治疗作用[28-29]。研究证实，Fucoidan可增强蛋白酶体抑制剂CFZ对DLBCL细胞的杀伤活性[15]，表现出较好的增效作用。目前，联合化疗仍是被广泛接受的治疗DLBCL的一线方案。但有研究显示，Fucoidan不能增强环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、强的松或伏立诺他的疗效，却能显著增强CFZ的抗DLBCL作用[15]。在该研究中，低浓度的CFZ只能杀死一小部分DLBCL细胞，但当与Fucoidan联合用药时，CFZ的抗DLBCL活性显著增强，即使是低浓度的Fucoidan与CFZ联合用药，也可以得到类似的结果。表明CFZ与Fucoidan有协同作用，且CFZ与Fucoidan联合用药也增加了对原代DLBCL细胞的细胞毒性，但对正常的CD34+细胞无显著毒性。

2.3 增强机体免疫活性 实验研究表明，Fucoidan可通过抑制辅助性T淋巴细胞2 (Th2)相关细胞因子如白细胞介素4(IL-4)和IL-13，增加干扰素γ的表达而增强NK细胞活性，进而发挥对小鼠B细胞淋巴瘤细胞系A20细胞及小鼠淋巴瘤细胞系YAC-1细胞的杀伤活性[30]。

2.4 抑制淋巴瘤细胞增殖与迁移 成人T细胞白血病/淋巴瘤(adult T-cell eukemia，ATL)是人类T细胞白血病病毒-Ⅰ型(HTLV-1)引起的恶性T细胞单克隆增殖疾病，为一种少见的特殊类型的T细胞受累的淋巴细胞白血病/淋巴瘤，而Fucoidan可以剂量依赖性显著抑制ATL细胞系的增殖与活力[31]。

3 海藻抗恶性淋巴瘤的机制研究

3.1 抑制核转录因子κB/激活蛋白-1/T-LAK细胞来源蛋白激酶(NF-κB/ AP-1/TOPK)信号通路 NF-κB在非激活状态，与核转录因子κB抑制因子α(IκBα)相互作用，使细胞胞浆内未受到刺激的NF-κB处于非激活状态下。而作为对增生信号刺激的反应，IκBα可通过泛素依赖的蛋白水解过程而被磷酸化和降解，导致NF-κB释放并形成游离的二聚体，继而这些二聚体转移到细胞核内，诱导相应肿瘤基因的转录[14]。研究表明，不同浓度的Fucoidan(2、4、6 mg/mL)处理PEL细胞48 h后，即可检测到Fucoidan呈剂量依赖性地抑制IκBα的磷酸化和降解，同时细胞核内的NF-κB相对含量减少，提示Fucoidan对PEL细胞NF-κB的活性及核转位均具有抑制作用。在PEL细胞中，AP-1复合物由JunB和JunD 两种蛋白组成，而Fucoidan可使PEL细胞中AP-1 DNA活性显著降低，且对JunB和JunD的蛋白表达有剂量依赖性的降低作用[14]。TOPK是一种丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)样蛋白激酶，也称T淋巴因子活化杀伤细胞来源性蛋白激酶，由细胞周期依赖性蛋白激酶1(CDK1)/Cyclin B1复合物激活，可促进细胞分裂，并参与致瘤，是IκBα的上游激酶。TOPK可与IκBα直接作用并磷酸化。而Fucoidan可直接作用于TOPK抑制其活性[14]，另外Fucoidan对TOPK的磷酸化也有抑制作用，但对TOPK蛋白总表达水平无显著影响。总的来说，Fucoidan可通过抑制IκBα和TOPK的磷酸化，以及AP-1家族蛋白JunB和JunD的表达，来抑制NF-κB、AP-1和TOPK信号通路[10]，下调抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-xL(Bcl-xL)、髓细胞白血病因子-1(Mcl-1)和X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)表达，进而诱导PEL细胞凋亡[14]。

在HTLV-1转化的T淋巴细胞系和ATL衍生的T淋巴细胞系中，PDZ结合激酶(PBK)/TOPK表达上调并磷酸化,同时能够磷酸化PBK/TOPK的CDK1/Cyclin B1在这些T淋巴细胞中也呈高表达水平。而Fucoidan可通过抑制PBK/TOPK信号通路呈剂量依赖性的抑制上述T淋巴细胞系的增殖和活力[31]。

3.2 调控细胞周期蛋白 细胞周期蛋白是细胞周期调控的核心分子，它与CDK和CDK抑制因子(CKI)等共同组成细胞周期的调控网络，以调节细胞的增殖，其调控机制紊乱与肿瘤的发生发展密切相关，在多种恶性肿瘤中呈现高表达状态，并在肿瘤治疗中发挥重要的作用[32]。有研究表明，Fucoidan对多种细胞周期蛋白均具有一定的调控作用[15]。如Fucoidan可使DLBCL细胞的细胞周期蛋白Cyclin D1、CDK4和CDK6水平显著降低[15]。p21蛋白属于CKI 分子之一, 是CDK相互作用蛋白/激酶抑制蛋白(Cip/Kip)家族成员，在控制G1/S周期转换过程中起重要作用，而Fucoidan可使p21Cip1水平显著升高[15]。位于染色体13q14的Rb基因，是第一个被发现和鉴定的抑癌基因，由Rb抑癌基因转录的Rb蛋白是G1周期跃迁的一个重要检验点，而Fucoidan可显著降低Rb蛋白在其Ser795末端的磷酸化水平，并降低E2F转录因子1(E2F1)水平，进而诱导DLBCL细胞发生G0/G1细胞周期阻滞，诱导DLBCL细胞凋亡[15]。

3.3 抑制细胞外调节蛋白激酶(ERK)信号通路和糖原合成酶激酶(GSK)磷酸化水平 ERK/GSK3β信号通路在肿瘤的发生、发展中起重要作用，其中GSK3β参与了肿瘤细胞的生长、增殖及转移、凋亡过程，还与肿瘤化疗的耐药有关，目前被视为恶性肿瘤治疗的一个重要靶点[33]。

研究显示，在Fucoidan处理人淋巴瘤细胞系HS-Sultan细胞24 h后，ERK和GSK磷酸化水平明显降低，而丝裂原活化蛋白激酶p38和蛋白激酶B(Akt)磷酸化没有显著改变，提示Fucoidan可能通过抑制ERK通路和GSK磷酸化水平对人HS-Sultan细胞产生抗瘤作用[16]。

3.4 提高NK细胞活性 T淋巴细胞和NK细胞是机体重要的免疫细胞，参与抗肿瘤免疫调节。研究表明，Fucoidan可提高Th1和NK细胞的免疫活性，增强对小鼠淋巴瘤细胞的抑制作用，介导淋巴瘤细胞破坏[30]。

3.5 调控CXC趋化因子配体12(CXCL12) CXCL12在肿瘤的发展和转移中起着核心作用。Fucoidan可通过增强与CXCL12的绑定使CXCL12诱导的ERK1/2信号通路受到抑制，进而降低淋巴瘤细胞系Raji细胞趋化性[34]。此外，Fucoidan还通过与CXCL12结合，阻断CXCL12诱导的其特异性受体CXCR4激活及MMP-9的迁移与分泌等下游效应，从而干扰人Burkitt淋巴瘤细胞中的CXCL12/CXCR4轴而发挥抑瘤作用[35]。

小结综上所述，无论是以海藻为主药的方剂还是海藻的有关提取物，均有一定抑制恶性淋巴瘤的功效，其主要作用体现在促进淋巴瘤细胞凋亡、增强蛋白酶体抑制剂杀伤活力、增强机体免疫活性、抑制淋巴瘤细胞增殖和迁移等方面；而其抗恶性淋巴瘤的机制主要体现在抑制NF-κB/AP-1/TOPK信号通路诱导肿瘤细胞凋亡、调控细胞周期蛋白诱导细胞周期阻滞、抑制ERK和GSK磷酸化水平阻断ERK信号通路、提高NK细胞活性增强机体免疫力、增强与CXCL12的绑定使CXCL12/ERK1/2信号通路或CXCL12/CXCR4轴受到抑制等几个方面。

目前，海藻在其他各种实体恶性肿瘤中的研究[36-38]非常丰富，包括食管癌、甲状腺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、结肠癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、神经母细胞瘤、肉瘤、腹水瘤等多种恶性肿瘤，其作用机制包括抑制肿瘤细胞增殖、清除诱导肿瘤细胞变化的自由基、促进天然免疫应答、破坏肿瘤细胞骨架及膜通透性、破坏肿瘤细胞的细胞器、激活caspase-3蛋白酶诱导肿瘤细胞凋亡、抗血管生成、栓塞肿瘤滋养动脉及免疫调节等诸多方面。但海藻抗恶性淋巴瘤的作用和机制研究尚处于起步阶段，相关研究文献较少。如以“中国知网”查阅文献为例，在其官方网站以“篇关摘”搜索引擎搜索“海藻 淋巴瘤”只能查出18条有关内容，其中期刊论文或会议论文仅有11条。在国外网站“PubMed”中搜索“algal and lymphoma(海藻和淋巴瘤)”或“fucoidan and lymphoma(褐藻多糖和淋巴瘤)”，前者仅可得到9篇文献，后者仅可得到15篇文献。至于海藻抗恶性淋巴瘤作用效能的评估、毒副作用、量效关系等均需进一步的深入研究加以明确，有关分子机制、作用靶点、如何改善分子结构以增进效能的研究，更需要全面地从细胞、分子、信号、免疫等方面多层次、多角度、多靶点加以阐释。