共刺激分子4-1BB与肿瘤治疗的研究进展

顾诠，冯继锋

1 4-1BB及其配体4-1BBL的结构和特性

4-1BB基因最早于1989年在小鼠身上被发现并报道，研究者在细胞毒性T细胞和辅助性T细胞增殖相关mRNA中发现了由256个碱基构成的4-1BB基因片段，并发现4-1BB在两种T细胞增殖的过程中都具有诱导作用且具有大量膜受体和跨膜蛋白的特性[1]。4-1BB在1996年召开的全世界CD命名大会上被命名为CD137，是一种相对分子质量为30 000的Ⅰ型跨膜蛋白，由细胞外区、跨膜区和细胞质内区三部分构成。人4-1BB基因最先从人外周血的活化T细胞的cDNA文库中利用分子杂交技术分离获得。人4-1BB基因定位于1p36，包含10个外显子和9个内含子[2]。4-1BB主要表达于CD4+T、CD8+T表面，也可表达于NK细胞、NKT细胞、肥大细胞、中性粒细胞和Foxp3+T细胞。其配体4-1BBL是一种Ⅱ型跨膜蛋白，主要表达于树突状细胞、B细胞及巨噬细胞这些专职抗原提呈细胞，也可以表达于肥大细胞、NK细胞、平滑肌细胞等[3]。

2 4-1BB信号通路在免疫中的作用

在机体产生肿瘤免疫应答的过程中，T细胞起到了至关重要的作用。T细胞活化需要“双受体”和“双信号”。T细胞抗原受体(TCR)与抗原肽的特异性结合，致使CD3胞内段“免疫受体酪氨酸激活模体(ITAM)”序列的磷酸化，并启动细胞活化的分子级联反应，为T细胞活化提供第一信号。第二信号即共刺激信号，由T细胞和APC表面的共刺激分子之间的相互作用所介导，4-1BB/4-1BBL是除CD28/B7之外的另一组重要的共刺激分子。CD28/B7协同刺激信号主要作用于T细胞活化前期，而4-1BB/4-1BBL的协同刺激信号主要作用于活化后期。除了活化上的协同作用外，4-1BB/4-1BBL的协同刺激信号对CD8+T细胞的存活和记忆性杀伤也至关重要。4-1BB分子通过激动性抗体的交联传递一种独特而有效的共刺激信号，导致CD4+T和CD8+T细胞的激活和分化。4-1BB通过TRAF2-NIK传导信号并激活NF-κB。通过4-1BB中继信号抑制诱导活化细胞死亡，并在活化后期维持免疫系统的功能。

4-1BB分子的抗体可增加移植物抗宿主反应，并根除已存在的肿瘤。干扰4-1BB/4-1BBL信号通路对一些免疫性疾病如HIV具有治疗作用。4-1BB缺陷的小鼠表现出免疫反应失调及对T细胞依赖性抗原免疫球蛋白的高反应性[4]。当CD28由于重复的刺激而下调时，4-1BB信号对于CD28的共同刺激在维持T细胞活化方面是至关重要的。4-1BB信号通过降低维持增殖和IL-2产生所需的抗CD28的阈值来与CD28共刺激信号起协同作用。4-1BB信号还通过增强Th1同时抑制Th2型细胞因子的产生来调节CD28介导的细胞因子谱。4-1BB信号介导Th1型细胞的生成，这一过程通过细胞内IFN-γ产生所识别。在表达4-1BB的细胞中可以检测IFN-γ诱导，而表达CD30的则检测不到IFN-γ的产生。4-1BB和CD30在CD4+和CD8+T细胞中均被诱导，但在每个T细胞亚群中，这两个分子的位置是相互排斥的。研究提示，4-1BB信号调节靶细胞亚群中的CD28共刺激，以利于Th1的发育和维持细胞的长期生长[5]。

除了作用于CD4+T和CD8+T细胞，4-1BB信号途径还可作用于其他细胞。Choi等[6]通过对比4-1BB完整的DC细胞和4-1BB缺陷的DC细胞的成熟过程，发现后者的成活率明显低于前者，由此认为4-1BB对于DC细胞的成活有促进作用。4-1BB可参与共刺激B细胞的增殖。除了共刺激性外，4-1BB还具有抑制性,在特定情况下，4-1BB可作用于B细胞，下调其数量和产生抗体的能力；也可对CD4+T细胞产生抑制作用[7]。4-1BB对于Treg作用至今存在争议，Elpek等[8]提出4-1BB在Treg的增殖中起正向促进作用并增强Treg对于免疫应答的抑制作用。而Choi等[9]的实验结论则是Treg内的4-1BB信号途径并不影响Treg的增殖，同时4-1BB信号通路还可以拮抗Treg的免疫抑制作用。

3 4-1BB信号通路与肿瘤的关系

肿瘤免疫的过程主要由T细胞完成，因此4-1BB在肿瘤免疫中有重要作用。4-1BB在血管壁、内皮层和血管平滑肌细胞中表达较强。实验结果显示，在32个健康组织样本中没有表达4-1BB的血管，在良性肿瘤(2/14)和炎性组织(2/9)中只有少数具有4-1BB表达的血管，然而在恶性肿瘤中有4-1BB表达的血管的比例明显增高(11/34)[10]。Kamijo等[11]通过实验证实5个皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)细胞系异常表达4-1BBL，抗4-1BBL中和抗体通过抑制AKT、ERK1/2、p38 MAPK和JNK的磷酸化而抑制CTCL细胞的增殖、存活以及CXCR4介导的迁移和体内生长。此外，4-1BBL信号还可以通过减少抗凋亡蛋白、Bcl-2和磷酸化不良来起到抗肿瘤的作用。研究者还研究了调节4-1BBL表达的转录因子。GATA6在许多4-1BBL表达异常的肿瘤中作为癌基因已被提出，研究发现GATA6在CTCL中表达以及GATA6在4-1BBL表达中的作用。DNA低甲基化和组蛋白乙酰化诱导CTCL细胞GATA6过度表达，GATA6直接上调4-1BBL的表达。GATA6通过上述途径抑制CTCL细胞的存活和体内生长[11]。Thum等[12]通过构建小鼠肿瘤模型研究4-1BB在肿瘤免疫中的作用，发现4-1BB可以促进CD8+T细胞增殖，同时促使CD8+向肿瘤内浸润。一方面4-1BB可以直接增强CD8+的免疫效应，另一方面可以通过增强CD4+T细胞、NK细胞的免疫功能来增强CD8+T细胞介导的肿瘤免疫应答。4-1BB信号通路可以增加促炎细胞因子的分泌，提升细胞溶解能力和增效抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用[13]。在胃癌中，癌细胞的免疫状态与4-1BB/4-1BBL的表达状态有关，如果肿瘤细胞4-1BBL呈高表达，则机体对于肿瘤细胞的杀伤作用会更强，反之，如果4-1BBL呈低表达，不能很好的构建4-1BB/4-1BBL信号通路，机体对于肿瘤的免疫监视作用便会减弱，更容易发生免疫逃逸[14]。Li等[15]使用4-1BBL基因修饰小鼠前胃癌细胞，使癌细胞呈4-1BBL高表达，数据显示小鼠体内高表达的4-1BBL可以明显延缓肿瘤的生长，并且上调肿瘤浸润淋巴细胞的细胞毒性，但在体外高表达的4-1BBL并不能抑制肿瘤的生长。由此认为4-1BBL对于肿瘤细胞并没有直接的杀伤作用，而是通过增强肿瘤浸润淋巴细胞的细胞毒性的方式来发挥抗肿瘤效应[15]。在前列腺癌中，癌细胞通过诱导树突状细胞凋亡来逃避免疫系统的杀伤，而激活的4-1BB信号可以通过上调Bcl-2、Bcl-xL的表达，增加TNF-α和IL-12的分泌来增强树突状细胞抵御癌细胞诱导的凋亡的能力[16]。一项探讨4-1BB表达与非小细胞肺癌关系的研究结果显示,4-1BB/4-1BBL在癌旁组织中呈高表达[17]。另一项探究4-1BB表达与胃癌关系的研究结果显示，4-1BB/4-1BBL在胃癌组织和外周血中也呈高表达，且表达水平与局部和全身的免疫状态有关[18]。在大肠癌患者血清中也发现4-1BB显著增高，后续ELISA法证实4-1BB在大肠癌的诊断中特异度为97%，敏感度为83%，有望成为新的早期大肠癌诊断标志物[19]。

4 4-1BB在肿瘤治疗中的应用

4.1 4-1BB在肿瘤化疗中的应用前景

Kim等[20]使用4-1BB抗体和环磷酰胺(CTX)联合治疗小鼠B16黑色素瘤，发现联合治疗产生协同抗癌作用，相较于单用其中任一种治疗都可以产生更多的肿瘤特异性CTL。联合治疗的抗肿瘤作用主要依赖于CD8+T细胞，CTX可以增强CD4+和CD8+T细胞表面4-1BB的表达，同时4-1BB抗体可以促进肿瘤特异性CTL的增殖，单独或联合应用CTX能有效抑制外周Treg的负向调节作用，还可以减轻化疗所带来的淋巴细胞减少等不良反应。4-1BB抗体与CTX有成为联合治疗方案的潜在可能，但还须后续研究进一步验证。另外有研究发现使用多柔比星可以增加CD4+T细胞表面的4-1BB表达。在CD4+T细胞活化的情况下，用多柔比星预处理的树突状细胞比用活化CD8+T细胞培养的树突状细胞具有更高的存活率。由此我们认为，肿瘤患者在进行4-1BB单抗治疗前使用多柔比星预处理，可能是增强抗肿瘤免疫应答的方法。其机制可能与增加抗原特异性CD4+Th1免疫应答有关[21]。

4.2 4-1BB在肿瘤靶向治疗中的应用前景

西妥昔单抗，一种EGFR靶向的IgG1单抗，用于治疗头颈部肿瘤和结直肠癌可使患者获益，但临床改善有限。研究发现在多种小鼠异种移植模型中，包括EGFR高表达的肿瘤、KRAS野生型和KRAS突变型的结直肠癌，联合应用西妥昔单抗和4-1BB单抗具有协同作用，导致肿瘤完全消退和延长存活时间，这种获益取决于NK细胞的存在。在接受西妥昔单抗治疗的患者中，循环和肿瘤内NK细胞上的4-1BB水平取决于接受西妥昔单抗治疗后的时间和宿主FcyRIIIA基因的多态性。NK细胞的4-1BB表达的增加直接与EGFR特异性CD8+T细胞的增加相关[22]。另外还有研究提示，4-1BB抗体与曲妥珠单抗[23]以及利妥昔单抗[24]联合治疗也有增效的作用。

4.3 4-1BB在肿瘤免疫治疗中的应用前景

4.3.1 与IL-12联合使用 癌症免疫治疗常常因受到抗肿瘤免疫应答的阻碍而失败。既往研究证实白细胞介素12(IL-12)产生强烈的自然杀伤(NK)细胞介导的抗肿瘤反应，并减少结肠癌细胞系诱导的肝转移。在结肠癌肝转移小鼠模型中，研究者联合应用IL-12和4-1BBL治疗小鼠，对照单用IL-12的小鼠长期存活率明显增高。腺病毒介导的IL-12和4-1BBL基因直接转移至肝肿瘤导致肿瘤消退，并产生强有力的、持久的抗肿瘤免疫，可能为结肠癌肝转移提供了新的诊疗思路[25]。

4.3.2 与免疫检查点抑制剂联合使用 阻断CTLA-4或激活4-1BB的抗体可促进某些小鼠对肿瘤的排异反应，但单药治疗免疫原性差的肿瘤例如B16黑色素瘤效果并不理想。Curran等[26]联合使用CTLA-4抗体与4-1BB抗体治疗黑色素瘤发现，联合治疗方案有协同作用，促使CD8+T细胞向肿瘤浸润并诱导抗肿瘤的免疫微环境重塑。Xiao等[27]利用共刺激分子4-1BBL单抗结合可溶性PD-1单抗建立有效的抗肿瘤免疫途径，在肝癌小鼠模型中，这样的联合治疗清除了荷瘤小鼠体内较小的肿瘤，而对于较大肿瘤，也有60%得到了清除。在结肠腺癌模型中，应用PD-1信号通路阻断和4-1BB信号通路激活联合治疗荷瘤小鼠，在其肿瘤局部发现大量T细胞浸润，相较于单用任一种治疗，4-1BB激活和PD-1阻断联合对肿瘤生长有明显抑制作用。单用抗PD-1抑制肿瘤生长的抑制作用不明显，用抗4-1BB单抗和抗PD-1联合治疗荷瘤小鼠具有最好的抗肿瘤反应[28]。进一步的研究表明4-1BB共刺激增强CD8+T细胞的功能，抗PD-1介导CD8+T细胞的再活化，从而发挥更强的抗肿瘤作用[29]。

4.3.3 在嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T)中的应用 CAR-T细胞成功根除肿瘤取决于CAR-T细胞的持久性和效应器功能。CD4+和CD8+T细胞可能表现出不同的持久性和效应表型，这取决于产生CAR的特定细胞内信号转导域(ICD)的身份。首先，共刺激分子的ICD显著提高了表达CAR的CD4+T细胞的体内持久性，这反过来又增加了CD8+T细胞的持久性[29]。这些数据表明，CD8+T细胞的持久性高度依赖于ICD提供的辅助效应，ICD用于重定向CD4+T细胞。其次，在第三代CAR中，ICOS和4-1BB的ICD结合显示出优越的抗肿瘤效果和增强的体内持久性。有趣的是，在第三代CAR中，膜-近端ICD在远端区域显示出主导作用。在第三代CAR-T细胞中观察到的最佳抗肿瘤和持久性益处要求ICOS的ICD位于细胞膜附近，并与ICOS跨膜结构域连接。因此，具有ICOS和4-1BB的ICD的CAR在实体瘤模型中显示出比现有的基于4-1BB的CAR更高的功效，并且是临床测试的有前途的治疗药物[30]。

4.3.4 在过继性T细胞回输中的应用 经基因修饰以表达选择性共刺激分子的人工APC(aAPC)为人类T细胞的多克隆扩增和过继免疫治疗提供了可重复、成本效益高和方便的方法。在已经研究的各种aAPC中，表达抗CD3和抗CD28的脱细胞的aAPC能有效地扩增CD4+T细胞，但不能扩增CD8+T细胞。基于细胞的aAPC能有效地扩增细胞溶解CD8+T细胞，但尚未确定最佳共刺激信号。而用HLA-A2-Fc融合蛋白与4-1BBL aAPC相连，可诱导特异性CD8+CTL扩增。此外，与使用CD28共刺激扩增的细胞溶解性T细胞相比，使用4-1BB共刺激扩增的CTL介导的细胞的细胞毒作用更强，部分原因是NKG2D上调。这些结果表明，4-1BB共刺激对在体外扩增记忆性CD8+T细胞是必不可少的，并且优于CD28共刺激产生Ag特异性产物用于过继细胞治疗[31]。

4.3.5 4-1BB相关的单克隆抗体 乌托米单抗(Utomilumab)和Urelumab是两个以4-1BB为靶点的新免疫药物。研究发现，浸润人和小鼠肿瘤的Treg细胞上4-1BB呈高表达。4-1BB单抗可以耗竭肿瘤内Treg细胞，同时促进效应T细胞增殖。这些不同的机制是竞争性的，并且依赖于抗体种型和Fcγ受体的有效性。在多种实体瘤模型中，给予优先消耗Treg细胞的抗4-1BB IgG2a单抗，然后给予激动性抗4-1BB IgG1单抗或抗PD-1单抗可增强抗肿瘤反应[32]。这些机制的研究为抗4-1BB单抗的临床应用奠定了基础。

Utomilumab是一种人源化IgG2激动性单克隆抗体，能有效、特异地与人4-1BB胞外段的结构域结合[33]。一项研究Utomilumab安全性、抗肿瘤活性、药代动力学和药效学的Ⅰ期临床实验[34]结果显示：23例既往接受过多线治疗的晚期实体瘤患者接受每3周Utomilumab和帕博利珠单抗(Pembrolizumab)的联合治疗，无剂量限制性毒性。治疗相关的不良事件多为1～2级，且没有因不良事件终止治疗的患者。6例(26.1%)患者疗效评估认定为部分缓解或完全缓解。在这6例患者中，有5例获得了持续时间6个月以上的抗肿瘤免疫效应。与无应答者相比，应答者外周血CD8+T细胞活性有升高的趋势。单独或联合给药时，Utomilumab和Pembrolizumab的药代动力学和免疫原性相似。

Urelumab是一种人源化IgG4单克隆抗体，通过部分覆盖4-1BB/4-1BBL结合位点来阻断相互作用[35]。一项探究Urelumab与纳武利尤单抗(Nivolumab)在RAG2-/IL2Rγ缺乏荷瘤小鼠体内抗肿瘤活性的研究数据显示，在移植人结直肠HT-29癌细胞或人胃癌细胞的免疫缺陷小鼠中，联合治疗方案明显减缓了肿瘤的生长，这可能与联合治疗之后产生IFNγ的活化人T淋巴细胞数量增加，以及肿瘤移植物中调节性T淋巴细胞数量减少有关[36]。Michiko等选取9例术前接受紫杉类+蒽环类药物新辅助化疗的三阴性乳腺癌患者术后的癌组织进行培养，在使用Urelumab处理后发现，Urelumab不仅可以增加CD8+T细胞增殖的数量，而且增强了它们的细胞毒作用[37]。Urelumab的药物相关不良反应主要是肝毒性，当药物剂量>1 mg/kg时肝毒性明显增加，另外也有骨髓抑制的不良事件报道，但多为1～2级。目前研究数据显示0.1～0.3 mg/kg的药物剂量是较为安全的治疗方案[38]。Urelumab联合细胞毒药物、伊马替尼、利妥昔单抗、西妥昔单抗、埃罗妥珠单抗等治疗多种转移性实体瘤及血液系统恶性肿瘤的临床试验正在进行中。

4.3.6 在肿瘤疫苗中的应用 肿瘤疫苗是近几年的研究热点，与传统的放化疗作用于病灶不同的是，肿瘤疫苗通过多种形式将肿瘤抗原导入人体内，增加APC的肿瘤相关抗原提呈，从而解除肿瘤所致的免疫抑制状态，并“教会”免疫系统去识别、定位、打击肿瘤细胞。从作用机制上来看，肿瘤疫苗和4-1BB单抗应该有协同的作用，前者激活机体的抗肿瘤免疫效应，后者进一步促进肿瘤特异细胞毒性T细胞的增殖和免疫效应。在AT-3乳腺癌模型和MC38结肠癌模型中，肿瘤疫苗和4-1BB单抗联合治疗可以降低肿瘤负荷，同时在肿瘤引流淋巴结中观察到骨髓细胞的浸润和在肿瘤组织中观察到CD8+T细胞、NK细胞和中性粒细胞的浸润。相比于联合使用免疫检查点抑制剂，4-1BB单抗与肿瘤疫苗联合使用展现出了更好的效果[39]。在MCA205纤维肉瘤小鼠模型中，肿瘤抗原致敏的树突状细胞疫苗联合4-1BB单抗明显减少了肿瘤的肺转移，同时在B16-BL6黑色素瘤模型中这样的联合治疗也使肺部病灶明显退缩而且获得了更长的生存期[40]。最新研究发现，在前临床小鼠模型中，肿瘤疫苗联合4-1BB单抗根除了B细胞淋巴瘤，这与荷瘤小鼠体内T细胞的细胞毒性显著增强、IFNγ产生以及T细胞增殖相关，且所有在治疗后存活的小鼠都产生了持久的抗肿瘤免疫[41]。

4.4 4-1BB在肿瘤放疗中的应用前景

放疗已经成为很多恶性肿瘤标准治疗中的一部分，除了直接杀伤恶性细胞外，放疗也有激活并增强肿瘤免疫应答的潜能。Shi等[42]报道在小鼠肿瘤模型中，高剂量的放疗可以诱导4-1BBL的表达，在EMT6肿瘤模型中4-1BB单抗与放疗的联合应用明显抑制了肿瘤的生长速度(肿瘤体积从200 mm3增长到1 000 mm3的中位时间从28.5 d延长到了40 d)，且延长了总生存期。联合使用4-1BB单抗在单次放疗方案和剂量分割放疗方案中均有获益。但这种治疗上的协同作用与放疗的总剂量和剂量分割方案有关。最新研究发现放疗可以诱导肿瘤微环境中VEGF的表达和4-1BB的共刺激作用，联合免疫治疗可以更好地控制局部肿瘤及远处转移，且降低免疫治疗的毒性。一项联合靶病灶放疗、4-1BB激活和CTLA-4阻断的研究显示，在胶质母细胞瘤小鼠模型中，这样的三联治疗减少肿瘤体积、提高小鼠生存率，并使其DFS延长50%以上[43]。在这样的联合治疗方案中，CD4+T细胞的耗竭是限制疗效的关键所在。4-1BB单抗联合放疗方案为包含颅脑肿瘤、肺癌在内的多种实体瘤治疗提供了一个新的选择。

5 展望

如上文所述，从4-1BB信号通路被发现开始的20年来，我们对于4-1BB/4-BBL的结构、特性及作用机制有了更详细的了解。对于许多传统放化疗疗效不佳的肿瘤以及一些难于管理的治疗相关毒副反应，4-1BB相关治疗手段显示出了良好的应用前景。随着肿瘤免疫学的发展和相关研究的进一步深入，4-1BB也许会为将来的肿瘤免疫治疗提供新的思路与方法。