共刺激分子B7家族在骨肉瘤中的研究进展

范梦科，张奇，陈伟，杨伟杰，齐莉莉，王玲

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是好发于青少年的恶性骨肿瘤，约占原发骨肿瘤的36%[1]。虽然OS治疗手段大幅提升，患者术后生存期延长，但仍有超过30%的病例出现复发或转移[2-4]。因而，寻找新的治疗方法以进一步改善OS患者预后极其重要。近年来，靶向治疗广泛应用于肿瘤领域，它可直接抑制致癌基因或分子，抑制肿瘤的恶性进展。在肿瘤微环境中，肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes，TILs)是肿瘤免疫的主要成分。T细胞是主要抗肿瘤效应细胞，它接受来自抗原提呈细胞 (antigen presenting cell，APC)和肿瘤细胞等共刺激信号，发生激活或抑制[5-7]。研究表明，T细胞常接受抑制信号，造成功能弱化，使肿瘤逃脱免疫系统监视[8-9]。例如，调节性T细胞(T-regulatory cells，Tregs)可通过CTLA-4结合效应T细胞表面B7-1和B7-2，抑制效应T细胞[10]，而其他成员B7-H1、B7-DC、B7-H3等亦对效应T细胞产生抑制作用。本文就B7家族分子在OS中的表达、调节与治疗的研究进展进行综合性论述。

1 B7家族在原发性OS中的表达及意义

1.1 B7-H1 B7-H1又称程序性死亡配体1(programmed death ligand 1，PD-L1)，PD-L1是Dong等[11]发现的B7家族第三个成员，与T细胞活化相关。研究发现，B7-H1介导的T细胞免疫反应具有双向性：当CD28分子不参与共刺激时，B7-H1提供正性共刺激的第二信号，促进T细胞活化；当T细胞从CD3和CD28获得信号而剧烈增殖时，B7-H1与T细胞的PD-1受体结合使之抑制[12]。一般情况下，B7-H1表达在多种细胞上，如APC，活化的T、B细胞，自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)和内皮细胞等[13-16]。同样，PD-1亦可表达在多种免疫细胞，如B细胞、激活的单核细胞、浸润的T细胞等[17-19]。B7-H1在肿瘤细胞上高表达时，它将使肿瘤微环境中免疫细胞群体受到抑制。

近年的研究已检测到PD-L1在肝癌[20]、食管癌[21]和白血病[22]等肿瘤组织中表达，并与患者的不良预后密切相关[12]。高表达PD-L1预示患者临床预后不良。在一项69例OS组织免疫组化研究中，测得PD-L1阳性率为43.5%，其表达影响患者的生存时间(P<0.001)[23]。Koirala等[24]研究发现，25%的原发OS表达PD-L1，当与表达PD-1免疫细胞共存时，其表达大幅度影响患者的生存率，表明OS细胞表达PD-L1对表达PD-1的免疫细胞有大幅度抑制作用。在体外研究中，敲除OS细胞系(KHOS)PD-L1基因，OS细胞生物学特性减弱，并且对化疗药物反应增强[25]。对比OS患者与正常人的外周血，发现在OS患者中检测到以辅助性CD4+T细胞为主的IL-21表达降低，而PD-1高水平[26]。OS细胞表达PD-L1可抑制辅助性CD4+T细胞IL-21分泌和增强CD8+T细胞IFN-γ分泌的功能[26]。PD-L1表达受到了多种方式的调节作用。组蛋白脱乙酰基酶(histone deacetylase，HDAC)可参与癌症基因表达、细胞增殖、凋亡等诸多过程。当敲除OS细胞系HDAC6后,STAT3激活增加，PD-L1上调,而抑制HDAC6，PD-L1表达则恢复[27]。Nie等[28]敲除OS细胞系(U20S)的STAG2(Stromal Antigen 2)后，得到了相同的效果。在转录水平的调节中，微小RNA(MicroRNA,miRNA)是一重要的群体。在一项荧光素酶报告基因研究中，miR-140可与mRNA 3’UTR结合而抑制PD-L1生成，同时其下游mTOR增殖信号减弱。重要的是，高表达miR-140使CD8+T细胞、骨髓来源的抑制性细胞(Myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)增加，而Tregs细胞减少。进一步研究显示，miR-140可以抑制有免疫力的C57BL/6J鼠肿瘤生长，而裸鼠不受影响[29]。然而，miRNA也可间接抑制PD-L1的表达，它可先作用于PTEN调节PD-L1转录效率[30]。综上所述，PD-L1表达涉及到包括DNA、RNA和蛋白质等多水平多过程的调控，因此，免疫治疗必须明确各调控层面的主次作用，才能更有效地抑制肿瘤。

目前，PD-1/PD-L1轴的靶向治疗已经应用于临床，并获得良好的疗效。然而研究发现，PD-1/PD-L1轴靶向药物与其他治疗的联合应用能获得更好的效果。SDF-1/CXCR4轴是促进MDSCs在OS微环境积累的一个重要因素。当联合应用CXCR4拮抗剂AMD3100与PD-1/PD-L1抗体治疗OS小鼠模型时，肿瘤生长速度减缓[26]。PI3Kδ/γ是一个可致外周血中MDSCs急剧增加的分子[31]。Shi等[32]联合PI3Kδ/γ特异性抑制剂(SNA)和PD-1抗体治疗OS小鼠模型，也发现了小鼠肿瘤生长减缓且生存延长。所以，MDSCs对于OS的免疫抑制作用可作为一个关键的联合靶。共刺激分子和化疗联合治疗对改善OS的生长也达到了上述效果，如Tim-3、PD-L1和OX-86三种抗体联合应用使OS转移发生率大幅降低[33-35]。OS致病的多因性决定了其治疗的综合性，从整体范围抑制OS的发展是未来OS治疗的一个重要方向。然而，多数研究尚且处于实验探究阶段，还需要更多的临床研究验证。

1.2 B7-DC B7-DC又称为PD-L2,PD-L2的结构与B7-H1类似，它的受体也是PD-1[36]。PD-L2表达于树突状细胞和活化巨噬细胞[37]，几乎不表达在其他正常组织。研究表明，PD-1与PD-L2结合抑制了T细胞的增殖、分泌和死亡。目前，PD-L2/PD-1在OS中仅有1篇相关性研究[38]。研究者行免疫组化染色测得PD-L2在原发OS中高表达，敲除OS细胞的PD-L2，其下游RhoA-ROCK-LIMK2信号失活，抑制了上皮-间质转化，使OS细胞迁移和侵袭能力削弱。在进一步的体内研究中，将敲除PD-L2的OS细胞注射入小鼠体内后，发现敲除PD-L2的OS细胞很少转移到肺部。该研究首先证明了PD-L2在OS中的表达特点和其对下游调节的基本机制。当然，还需要大量的实验研究进一步证明。

1.3 B7-H3 B7-H3是Chapoval等[39]在人类的cDNA文库中首先发现的，由于结构类似B7家族,因此命名为B7-H3。研究发现，B7-H3 mRNA可表达在人类正常组织，如：上皮细胞、成骨细胞和成纤维细胞等[40-41]。B7-H3蛋白肿瘤组织中的表达更为广泛。到目前为止，已发现B7-H3蛋白在多种癌组织中高表达,包括肝癌[42]、肺癌[43]、前列腺癌[44]、肾癌[45]、乳腺癌[46]、食管癌[47]等，并与肿瘤的恶性度和患者不良预后密切相关。

B7-H3在OS的表达明显高于PD-L1，并与患者的生存期有密切的联系。Wang等[48]分析了61例原发性OS患者的病理组织，发现B7-H3的阳性率高达91.8%(P<0.001)，相应的，患者生存和复发时间均缩短；同时，在高表达B7-H3的肿瘤组织中，检测到少量的CD8+T细胞，说明OS细胞表达B7-H3可能对免疫功能有抑制作用。在建立的OS小鼠模型中，发现转移性OS的B7-H3呈过表达型，并具高侵袭性[49]。过表达的miR-124直接结合B7-H3 mRNA，抑制其翻译，而沉默miR-124可削弱OS细胞的增殖与侵袭[50]。另外，hsa_circ0021347作为一种环状RNA分子亦能影响B7-H3的表达。在生物信息学分析中，Wang等[51]观察到miR-646和hsa-miR-1205同时参与并促进OS的发展。在外周血中，同样检测到OS患者的B7-H3水平明显升高，并与肿瘤临床分期、转移和患者预后有很大的相关性[52]。然而，目前B7-H3表达调节的研究还比较局限，有待进一步研究扩展，如表观遗传学、通路蛋白的调节作用等。嵌合抗原受体(CAR)T细胞是通过靶向分子受体对T细胞的修饰使得T细胞获得更为精准的肿瘤识别功能，同时可激活自身，从而更有效地杀灭肿瘤细胞。研究表明，CAR T细胞在治疗复发性小儿急性淋巴细胞白血病中已显示出巨大疗效[53]。在OS中，Gardner等[54]开发的一种B7-H3 CAR T细胞，通过治疗OS小鼠模型，发现它可使肿瘤大幅减小。因此，B7-H3 CAR T细胞有可能成为未来OS治疗的一个方向。

1.4 B7-H4 B7-H4是2003年利用生物信息学方法发现的免疫细胞活化协同刺激因子[55]。B7-H4蛋白在肾、乳腺和胃肿瘤中表达，负性调控T细胞，可使T细胞周期停滞、细胞因子减少并诱导其凋亡，促进肿瘤发展[56-59]。B7-H4在OS中也有很高的阳性表达。Dong等[60]对比104例OS患者与健康人的B7-H4表达情况，检测到有70.19%肿瘤组织表达B7-H4，OS患者外周血B7-H4水平明显高于健康人，且OS组织和血清的B7-H4高水平与肿瘤分期及转移密切相关，与患者的生存时间联系紧密；单因素分析显示，肿瘤分期、远处转移、肿瘤组织和血清B7-H4表达水平与总体患者生存率相关；多因素分析表明，肿瘤分期、肿瘤组织和血清B7-H4表达水平是独立预后因素。所以，进一步探索OS的B7-H4表达的调节因素意义重大，极有可能成为OS免疫治疗的新靶点，外周血中B7-H4的浓度可做为OS诊断特异指标。

2 B7家族在转移性OS中的表达及意义

共刺激分子过度表达是OS转移的重要环节，过表达共刺激分子将进一步抑制肿瘤微环境的免疫成分，导致OS转移的发生。Sundara等[61]在对临床标本的免疫组化分析中，检测到48%的转移性OS组织高表达PD-L1，而OS早期高表达PD-L1将很大程度上促进OS的转移(P=0.011)[62]。ROC曲线分析发现，PD-L1表达水平对OS转移具有预测价值[63]。与原发OS相比，PD-L2在转移性OS中也呈过表达[38]。所以，高水平的PD-L1与PD-L2可能是OS转移的基础。同样，在免疫靶向治疗的研究中发现，PD-1抗体使OS肺转移小鼠的生存时间延长，肺转移瘤减小，NK和巨噬细胞的浸润程度增加[64]。而联合性治疗将进一步增强抗OS的效果。将放疗与PD-1联合治疗OS转移瘤小鼠时，出现了更明显的肿瘤消除效应[65]。Lussier等[66]应用PD-L1和CTLA-4抗体联合治疗转移性OS小鼠，也出现了上述的效果。因此，靶向治疗PD-L1/PD-1在原发与转移性OS小鼠模型均具有良好的疗效，尤其是联合PD-L1/PD-1与其他免疫靶向治疗或辅助治疗，将进一步消灭肿瘤，增加荷瘤小鼠的生存时间。在对转移性OS的研究中,免疫组化检测到B7-H3在晚期肺转移OS中过表达，B7-H4过表达与OS患者远处转移密切相关[60]。目前，共刺激分子在转移性OS的研究还较少，但其在OS转移中的地位相当重要，尤其是B7-H3与B7-H4，极有可能成为OS免疫治疗的新突破点。

3 展望

目前研究表明，PD-L1/PD-1、PD-L2、B7-H3和B7-H4在骨肉瘤的进展中发挥重要的作用，对患者预后有较好的预测。靶向PD-L1/PD-1轴治疗获得了较好的体内外实验结果，尤其与其他药物联合应用比单一PD-L1/PD-1抗体治疗更有优势。B7-H3和B7-H4表达与OS进展亦有密切联系，并且明显影响患者的生存时间。然而，对B7-H3和B7-H4的研究还处于起步阶段，其表达与调节机制还有待进一步的验证，两者在外周血中的表达浓度可作为OS诊断的特异分子。