流感病毒与肺炎链球菌共感染动物模型的国内外研究进展

赫昊， 王雪峰， 张秀英， 黄婉怡， 王爽

流感是影响人类健康的常见传染病之一。流感病毒其抗原变异性强，传播迅速，每年可引起季节性流行，在人群聚集机构易发生爆发疫情。肺炎链球菌是一种革兰阳性厌氧菌，在正常人的口腔及鼻咽部经常存在，只形成带菌状态，通常不致病，在免疫力低下，婴幼儿、年老体弱者易发生肺部感染。据统计，自16世纪以来，全球性的“大流感”至少爆发过30次。一百年前的1918年流感是第一次世界范围传播的流感，据保守估计造成了全球约5 000万人死亡。据推算，全球每年有300万人因流感感染住院，25万人死亡[1]。尽管抗菌药物、流感疫苗早已问世，肺炎链球菌疫苗投入使用也已10余年，但是流感流行期间，其继发的细菌感染仍可导致严重疾病，甚至在世界范围内造成严重的死亡率和发病率[2]。流感与细菌混合感染病情复杂，机制混乱，因此成功构建流感病毒与肺炎链球菌混合感染动物模型对明确共感染的免疫应答机制及探索正确治疗顺序是及其重要的环节。本文主要对构建共感染模型动物的选择、病原测定、造模时间选择等过程方法进行综述，以期为今后的相关科学研究做好铺垫。

1 流感病毒与肺炎链球菌共感染现状

研究表明，在过去100年的4次流感大流行期间，50%～90%的严重或致死性流感病毒感染与细菌感染有关[3-6]。据报道，至少有15种能合并流感病毒感染的细菌。其中至少4种类型的细菌包括肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、嗜肺军团菌和流感嗜血杆菌增加了肺炎的风险和随后的死亡率[7-10]。

流感病毒与肺炎链球菌的共同感染存在多种因素可导致肺炎[11-14]。与单一感染相比，流感病毒感染后，低剂量的肺炎链球菌即可造成严重感染[15]。有研究证实，共感染期间TH17免疫应答受到抑制、自然杀伤细胞功能受限、营养因素、宿主自身因素等都会改变宿主的免疫反应或肺内稳态，从而阻碍病毒细菌清除[16-19]。

2 模型研究

2.1 动物种类 根据国内外文献记载，目前共感染模型普遍选择小鼠，常用类型为BALB/c、CBA/J、C57BL/6三种。性别选择雌雄均可，鼠龄6～12周。有研究结果表明，滴鼻感染流感病毒PR8可引起小鼠在急性期体质量下降，肌肉酸痛，活动性降低，伴随明显的抑郁焦虑情绪；且BALB/c小鼠对流感病毒PR8的敏感度较C57BL/6小鼠明显，更适宜做流感病毒PR8感染的小鼠[20]。另外雌性小鼠有动情周期，激素水平可能会影响行为[21]。

2.2 病原种类的选择

2.2.1 流感病毒 流感病毒通常选用流感病毒A/PR/8/34(H1N1)。流感病毒持续进化，不断出现新的亚型。有研究表明，流感病毒A/PR/8/34(H1N1)是一种高致病性的小鼠适应病毒，肺炎链球菌可以黏附在气管内暴露的部分基底膜上，此型流感可与细菌共同孵育[22]。

2.2.2 肺炎链球菌 肺炎链球菌的选择以普遍流行为原则。肺炎链球菌可根据荚膜多糖抗原的不同，分为90多种血清型。在中国，19群肺炎链球菌(主要为19F和19A)一直是儿童中最为流行的血清群，其他较为流行的血清型为6B、14和23F[23-25]。

2.3 病原滴度的测定

2.3.1 流感病毒的测定 流感病毒的滴度测定一般有两种常用方法，半数组织感染量(TCID50)[26]和空斑分析。空斑分析是检测病毒感染颗粒滴度的一种常用方法。感染性滴度的单位一般表示为PFU/mL，其中PFU(plaque forming unit)表示空斑形成单位。空斑分析的优势在于可以直接用肉眼看到一个一个空斑，但是它的重复性比较差。TCID50基于泊松分布的统计学原理，所得结果更稳定。

2.3.2 肺炎链球菌的测定 肺炎链球菌的计数方法一般有两种方法：平板菌落计数法和麦氏比浊法。平板菌落计数法[27]是取一定容量的菌悬液，作一系列的倍比稀释，然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数，可算出培养物中的活菌数，以CFU为单位。此法灵敏度高，目前在国际上广泛应用。麦氏比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量，可用光电比色计测定菌液，用光密度(OD值)表示样品菌液浓度。此法简便快捷，但只能检测含有大量细菌的悬浮液，得出相对的细菌数目。

2.4 造模方法

2.4.1 流感病毒感染后与肺炎链球菌混合感染 流感病毒感染后2～3日，病毒滴度达到高峰，随后接种肺炎链球菌。在流感病毒与细菌感染的重症肺炎的免疫动力学研究中，选择在分组后先对小鼠接种流感病毒，按50 μg/kg的戊巴比妥钠进行麻醉，直立状态下经鼻接种1×104PFU/mL流感病毒50 μL，混合感染组2日后经鼻接种1×108CFU/mL肺炎链球菌50 μL，随后分析小鼠肺中病毒滴度、细菌数量和免疫反应的动力学，如细胞因子和趋化因子。一些关键免疫介质，包括Toll样受体/丝裂原活化蛋白激酶信号、环氧合酶表达和前列腺素E2的产生[26]。有学者在实验中通过流感病毒感染后3 d接种肺炎链球菌，来探索颗粒蛋白前体调控流感病毒感染后小鼠对细菌易感性的机制[28]。

2.4.2 流感病毒感染恢复后继发肺炎链球菌感染 在流感病毒感染后增强对肺炎链球菌易感性的研究中，小鼠用异氟醚吸入麻醉，流感组小鼠滴鼻接种10 TCID50流感病毒，空白组接种磷酸盐缓冲液50 μL为对照，接种流感病毒14 d后，通过实时定量PCR法测定小鼠体内流感病毒清除干净，14 d后滴鼻接种1×104CFU/mL肺炎链球菌50 μL。从流感病毒感染中恢复过来的小鼠对随后的肺炎链球菌高度敏感，实验组小鼠致死率较对照组大大增加，流感恢复期小鼠肺组织白细胞介素-10比对照组高50倍。接种前用抗白细胞介素-10单抗处理，可使继发性细菌性肺炎的细菌生长减少，致死率明显降低[29]。

2.4.3 肺炎链球菌感染后与流感病毒混合感染 此种造模顺序用于致死性研究。麻醉状态下的小鼠滴鼻5×105CFU/mL肺炎链球菌致死剂量100 μL(50 μL/鼻孔)，7 d后滴鼻相同剂量流感病毒致死剂量3 000 TCID50。研究表明流感病毒和肺炎球菌双重感染小鼠模型中存在协同死亡率，肺炎链球菌攻击后发生100%致死率流感病毒感染需7 d。尽管在第3天和第5天组中也观察到了100%的死亡率，但第7天的死亡最快，发生在24 h内。在所有小鼠中，第3天接受流感病毒感染的小组，平均生存期为3.3 d，在第5天接受感染的小组，平均生存期为2.5 d。第21天失去了协同作用。这些数据表明必须有一定时间序列的事件才能发生协同杀伤力，揭示在此模型中，肺炎球菌感染后7 d感染了流感病毒以最快，最彻底的死亡率死亡[15]。

2.5 模型鉴定

2.5.1 一般状态 接种病原后，小鼠出现体质量下降，精神萎靡、进食减少、活动量减少及毛发立起等状态[30]，临床中，流感病毒感染除引发呼吸道症状外，严重时还会造成流感相关脑症综合征，研究中小鼠还会出现自发行为改变，伴随抑郁、焦虑、紧张等情绪[20]。

2.5.2 肺叶中病原滴度测定 处死小鼠后，在无菌条件下取出肺，用无菌磷酸盐缓冲液在肺中洗涤3次，肺同源物直接用于细菌培养(可离心)，上清液用于定量肺炎球菌菌落计数，肺炎球菌的鉴定通过目视检查和标准识别菌落形态来完成[15]。流感病毒的鉴定可应用克隆测序基因比对方法结合反转录聚合酶链式反应病毒载量检测[31]。

2.5.3 肺部病理切片 肺部改变通常涉及肺气道或肺实质。肺部切除后进行苏木精-伊红染色，并在显微镜下检查病理学改变。气道改变主要见于感染病毒的小鼠，管腔、黏膜上皮坏死或过度增生。多发性实质性灶伴肺泡发炎，肺泡上皮细胞肥大和增生，肺泡坏死和纤维蛋白沉积[15]。

3 讨论

一直以来，流感的爆发是威胁世界卫生的主要因素，而流感后继发细菌感染更是提高了肺炎致死率，其中以儿童、老人及体弱者尤为易感。流感病毒不仅严重危害了畜禽养殖业，并且对公共卫生安全具有巨大的潜在威胁。据WHO统计，2013年H7N9流感病毒爆发以来，目前已经造成1 567例人感染，其中死亡615人，致死率高达39.2%[32]。肺炎链球菌是引起继发性肺炎的主要病原体。中医在共感染动物实验研究中，共感染模型动物可以选用BALB/c、CBA/J、C57BL/6小鼠，流感病毒则最宜采用流感病毒A/PR/8/34(H1N1)，病毒滴度的测定可根据实验室条件和实验人员技术进行优化选择，常用方法为TCID50和空斑实验。细菌计数常用平板计数和麦氏比浊法。共感染造模方式为麻醉后滴鼻接种，接种时间的确定则根据研究目的而选择。近几年，有实验采用气管造模的方法，在雾霾环境下进行IV感染，在采用PM2.5气管滴注联合IV感染对小鼠进行造模后，其成模的显著性高于单一IV感染[33]。造模将小鼠深度麻醉后悬吊，从前切牙成60°～70°，将一根钝头弯曲的18 g针头插入气管，悬浮于隆突上方，直接向肺中注入50 μL感染液。然后将小鼠的鼻孔阻塞，直到观察到大喘气[34]。此种方法研究结果更加准确，但难度较大，需要实验人员熟练的技术配合。实验中要注意病原剂量、小鼠致死率等问题。目前，国内外共感染动物实验例数较少，还需要通过大量基础实验来验证最优模型,同时有利于其他合并病原感染的研究，腺病毒与支原体等感染同样是儿童常见重症肺炎的原因[35]。流感和细菌共感染发病机制复杂，致死率高，成功构建共感染模型将为明确共感染发病机制、预防、治疗重症流感打下基础。