胃癌病理类型及分期与胃癌组织中PI3K/CREB表达水平的相关性分析*

张小辉 王海伟 孙 颖 王 静 王云鹏

（1 邯郸市中心医院病理科，邯郸 056001；2 河北医科大学附属医院消化内科，石家庄 050017）

胃癌死亡率仅次于肺癌[1]，其发病率与患者年龄呈现正相关，男女患者人数比例约为2∶1[2]，该病患者年龄呈年轻化趋势[3]。大多数患者确诊胃癌时通常已属进展期，治疗方案较为复杂、难度升高，传统的手术及放化疗治疗预后较差。研究显示早期胃癌经有效诊断，并及时干预治疗，患者存活率可提高至90%以上，而晚期胃癌患者的术后存活率不超过30%。因此寻找简单、有效的早期胃癌筛选方法非常重要。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）是细胞转导的磷酸化酶，能够在细胞的转录、翻译和代谢以及肿瘤发生过程中发挥关键作用[5]。cAMP 反应序列结合蛋 白（cAMP responsive element binding protein，CREB）通过蛋白激酶磷酸化激活后可持续刺激重要目标基因表达，在肿瘤的发生发展中有重要作用[6]。在胃癌进程中均检测到PI3K、CREB 异常表达，提示其可能参与了胃癌细胞的发生进程[7]。本研究重点探讨胃癌病理类型及分期与胃癌组织中PI3K/CREB 表达水平的相关性。

1 材料和方法

1.1 一般资料

选取2017年6月～2019年6月于本院治疗的140 例手术治疗的胃癌患者，取患者胃癌组织以及癌旁1 cm 处组织石蜡包埋，存于-80℃液氮。患者中位年龄52.3 岁±4.9 岁，其中男性患者76 例、女性患者64 例。

1.2 纳入标准

①符合胃癌诊断标准；②首次胃癌根治术治疗患者；③均存在明确TNM 分期及组织学分级的患者；④患者知情，且无条件配合此项目研究。

1.3 排除标准

①经过放化疗冶疗的患者；②患者资料不完整；③合并其他恶性肿瘤或重要器官衰竭。

1.4 试剂

兔抗人多克隆抗体及单克隆抗体（美国Abcom 公司）；DNA 裂解液（武汉碧云天Co.Ltd）；以及PBS 缓冲液（南京金益柏Co.Ltd）；DAB 显色剂（北京金克隆Co.Ltd）；免疫组织化学SP 试剂盒（武汉艾迪抗Co.Ltd）等。

1.5 免疫组织化学检测阳性细胞

1.5.1 免疫组织化学检测 取样本脱蜡水化，H2O2失活，低火加热1 min 修复抗原，加血清封闭，然后加一抗，PBS 冲洗，再加入二抗，最后加入DAB 显色剂染色，PBS 清洗，全程按照说明书操作，显微镜随机选5 个视野观察结果。

1.5.2 染色结果判断 胃癌组织中的阳性信号为淡黄色至棕褐色，CREB 阳性位于细胞核，PI3K 阳性定位于细胞质。

1.5.3 4 级记分评价方法 具体评价方法见表1。

表1 记分标准

1.6 免疫印迹检测蛋白表达

取胃癌组织50 mg 加入裂解提取蛋白，分装后于-20℃冻存，提取组织中总蛋白测定浓度，100 V SDS-PAGE 对总蛋白进行电泳，然后将蛋白样品转移到PVDF 膜上，加脱脂奶粉封闭1 h。加入一抗后TTBS 漂洗，间隔10 min，一共3 次漂洗，最后加入二抗，常温环境中封闭1 h，取出PVDF 膜TTBS 漂洗3 次，每次10 min，GAPDH 作内参，DAB 显色后照相。

1.7 统计学处理

采用SPSS 23.0 软件对检测结果进行分析，PI3K、CREB 蛋白表达采用n（%）或±s（符合正态分布）表示，行χ2或t检验进行比较，生存率比较采用log-rank 检验，GraphPad Prism 7 绘制受试者工作特征曲线（ROC 曲线），以P<0.05 判断为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PI3K/CREB 在胃癌组织、癌旁组织阳性表达率

免疫组织化学法检测结果显示，PI3K 在胃癌细胞胞质中呈颗粒状阳性表达，分布不均匀，CREB 在胃癌细胞核中呈现阳性棕黄色颗粒表达。PI3K 在胃癌组织中的阳性率是68.57%，在癌旁组织中阳性率为35.71%，两者对比，前者阳性率较高（P<0.05）；CREB 在胃癌组织中阳性表达率（72.86%）较癌旁组织（40.00%）明显升高（P<0.05）（表2，图1）。

图1 免疫组织化学法检测PI3K（A1、B1）/CREB（A2、B2）表达情况，标尺=50 μm

表2 PI3K/CREB 在胃癌组织、癌旁组织中表达情况对比[n/（%）]

2.2 PI3K/CREB 在胃癌组织、癌旁组织蛋白表达量

免疫印迹检测结果显示，胃癌组织中PI3K/CREB的蛋白表达量均高于癌旁组织（P<0.05）（图2）。

图2 胃癌组织、癌旁组织中 PI3K/CREB 蛋白表达

2.3 PI3K/CREB 阳性表达与临床病理类型及分期的相关性

胃癌组织中PI3K、CREB 在低分化（81.72%，86.02%）、Ⅲ+Ⅳ期（79.05%，82.86%）中阳性表达率均高于其在高中分化（42.55%，46.81%）、Ⅰ+Ⅱ期（37.14%，34.29%）的表达（P<0.05）；PI3K、CREB 在其他临床特征中的阳性表达率比较差异均无统计学意义（P>0.05）（表3）。

表3 PI3K/CREB 阳性细胞数与临床特征的相关性（n=140）

2.4 PI3K/CREB 蛋白相对表达量与临床病理类型及分期的相关性

胃癌组织中PI3K、CREB 在低分化（0.934±0.029，0.729±0.059）、Ⅲ+Ⅳ期（0.732± 0.028，0.712±0.021）蛋白表达水平均高于高中分化（0.284±0.015，0.303±0.013）、Ⅰ+Ⅱ期（0.505±0.021，0.449±0.018）中的表达（P<0.05），在其他临床特征中的PI3K、CREB 蛋白表达比较差异无统计学意义（P>0.05）（表4）。

表4 PI3K/CREB 蛋白表达量与临床特征的相关性（n=140）

2.5 PI3K/CREB 表达与生存率的关系

96 例PI3K 阳性、106 例CREB 阳性表达患者5年内生存率（19.00%，20.00%）低于PI3K、CREB 阴性表达患者（26.00%，25.00%），组间比较差异有统计学意义（P<0.05）（图3）。

图3 PI3K/CREB 阴性、阳性患者的生存率比较

2.6 ROC 曲线分析

ROC 结果显示，PI3K 诊断胃癌的ROC 曲线下面积（AUC）为0.765，灵敏度为78.64%、特异度为62.46%，CREB 诊断胃癌AUC 面积为0.774，灵敏度为70.93%、特异度为64.75%，说明检测PI3K、CREB 水平对胃癌预后诊断具有重要意义（图4）。

图4 ROC 曲线分析

3 讨论

胃癌是导致全球死亡率升高的主要原因，胃癌的发展也是多基因循序渐进由少到多的累积性疾病，其中大量癌症基因表达异常，目前已经了解到多个致病因子在胃癌中活性升高，通过基因靶向干预的研究成为胃癌研究的热点，但是当前胃癌的治疗靶点及相关靶向药物尚不能满足临床需求，许多胃癌亚型治疗效果不佳[8-9]。因此，开发新的靶点对于胃癌的早期诊断及有效治疗至关重要。

本研究通过免疫组织化学法和免疫印迹检测样本中的PI3K/CREB 表达，结果显示PI3K/CREB在胃癌组织中的表达更高，同时结果还显示PI3K、CREB 阳性表达的患者术后生存率低于阴性表达患者，说明PI3K/CREB 与胃癌预后具有相关性。PI3K 在多种生长因子、细胞因子刺激下会出现异常活化，激活下游底物蛋白激酶B，导致其磷酸化，诱导胃癌细胞生长、分化和侵袭[11-12]。周诗琼等[13]研究表明PI3K 在胃癌组织中过度表达与胃癌的发展进程相关。同时其研究还表明胃癌细胞分化程度越低，PI3K 蛋白表达量越高，说明PI3K 表达可促进胃癌的恶性进展。PI3K 激活后可影响下游细胞凋亡调节因子、周期调控蛋白等靶分子，加快胃癌细胞分化，促使其转换至合成DNA 期、有丝分裂期，抑制细胞凋亡，恶化病情。CREB 是一种能够刺激基因转录的核内蛋白，在调节细胞分化、新陈代谢、控制细胞行为以及基因转录等方面扮演重要角色[14-15]。CREB 在非小细胞肺癌、胶质瘤、黑色素瘤等多种实体瘤中表达上调，且参与多种肿瘤的生物学行为如促进细胞增殖、抑制凋亡等。CREB通过转录调控其下游靶基因，参与肿瘤异常增殖、凋亡及侵袭等生物学行为。在胃癌中，CREB 高表达与淋巴结转移、远端转移、肿瘤分期及患者不良预后有关，并提示CREB 可能为胃癌的独立预后标志物[16-17]。

本研究结果显示，在低分化、Ⅲ+Ⅳ期的肿瘤组织中PI3K/CREB 的表达更高，说明PI3K/CREB 表达随病情的进展增强，与胃癌的恶性进展有关。ROC 曲线结果显示，PI3K 诊断胃癌AUC 面积为0.765，灵敏度为78.64%、特异度为62.46%，CREB 诊断胃癌AUC 面积为0.774，灵敏度为70.93%、特异度为64.75%，说明检测PI3K、CREB 对胃癌诊断存在意义。PI3K 在恶性肿瘤中属于原癌基因，能够随着恶性肿瘤变异过程其表达升高。徐艳山等[18]研究显示，CREB 在胃癌组织中呈阳性表达，与患者低分化及病理分期相关。CREB位于人染色体2q33.3，己经有多个研究报道其参与不同肿瘤类型的发生发展，通过下调CREB 能够抑制胃癌生长、侵袭与血管生成。PI3K 细胞信号转导通路参与胃癌的发生、发展、浸润转移，可以作为胃癌预后的独立指标[19]。Liu 等[20]报道，PI3K与胃癌侵袭、转移密切相关，PI3K 与Akt 可能存在协同作用，共同促进胃癌的恶性进展。

综上所述，PI3K、CREB 在胃癌组织中呈现高表达，且与胃癌疾病进展存在相关性，对胃癌预后诊断具有重要意义。