红景天苷对烟雾暴露大鼠肺微血管内皮细胞活性及细胞核因子-κB/Bcl-2表达水平的影响*

黄 会 曾玉兰 廖珍慧 施玉琴 黄 露 周月泉

（华中科技大学同济医学院附属梨园医院，武汉 430077）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是呼吸系统的常见病、多发病，40岁以上人群COPD的患病率达到13.7%[1]，在吸烟人群中也有约24%患有此病[2]。研究证实，香烟烟雾可以导致机体肺组织产生炎症反应[3]。烟雾暴露可通过炎症反应、氧化应激、血管活性物质调节细胞内免疫应答通路引起肺血管平滑肌细胞增殖，导致管壁增厚，管腔狭窄，血管管腔纤维化或完全闭塞[4]。肺微血管内皮细胞（pulmonary microvascular endothelial cell，PMVEC）在肺损伤过程中较为活跃，介导疾病发生发展。生理条件下，它们依靠其正常的增殖和凋亡平衡维持着细胞数量的稳定和血管功能正常[5]。研究表明，细胞抗凋亡因子B 淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）和细胞核因子-κB（nuclear factor-κB，NFκB）在PMVEC 中均有表达，可能介导COPD[6]。红景天苷是中草药红景天的一种提取物[7]，具有较强的抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗衰老、抗COPD 及抗缺氧等特性[8-9]。然而红景天苷能否调节烟雾暴露大鼠PMVEC 活性及对PMVEC 的调控作用机制尚不清楚。因此本研究探究红景天苷对烟雾暴露大鼠PMVEC 活性及NF-κB/Bcl-2 表达水平的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物和试剂

选择50 只健康成年SD 大鼠，CV 级，雌雄不限，体质量250～350 g，均由郑州大学实验动物中心提供，常温饲养。

散花牌过滤嘴香烟由河南中烟工业有限公司生产，每支焦油含量为13 mg，尼古丁含量为1.0 mg，CO 含量为14 mg；红景天苷由上海源叶生物科技有限公司生产；多聚甲醛购自上海芸强化工有限公司；Bcl-2 兔抗、NF-κB 兔抗和DAB 显色试剂盒均购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.2 动物分组与模型建立

50 只大鼠随机分为空白组，烟雾组，红景天苷低、中、高剂量组。制备大鼠被动吸烟装置，烟熏箱大小为115 cm×65 cm×50 cm，每侧各留9 个直径2.5 cm 的通气孔。被动吸烟实验中，10 支香烟捆扎为一组后点燃，并置于烟熏箱中的支架上。用测氧仪对烟熏箱中氧气的浓度进行监测，根据测得的结果对箱中的通气孔数量进行适当调节，使箱中氧气浓度尽量保持在20%。所有大鼠每天吸烟2次，每次吸烟间隔4 h，制备COPD 大鼠模型。空白组大鼠不做任何处理，常规饲养；烟雾组大鼠分别置于烟熏箱内，在4 周内每天吸烟2 次，每次吸烟10 支，每次30 min，中间间隔4 h；红景天苷低、中、高剂量组大鼠在烟雾吸入基础上分别给予50、100 mg/kg 和200 mg/kg 的红景天苷，均腹腔注射；空白组和烟雾组大鼠同期给予同等容积的灭菌注射用生理盐水经腹腔注射。所有大鼠共干预16 周，每周干预6 d，每天1 次。

1.3 标本采集

麻醉所有大鼠后处死，打开大鼠的胸腔，把大鼠的右主支气管进行结扎，将右肺快速取出，分离出右肺动脉，将取出的右肺保存在-80℃备用。左肺用4%多聚甲醛经气管充分灌注直至胸膜平整，结扎左主支气管后剪下，放入4%的中性甲醛固定液中，用于H-E 染色。

1.4 肺组织H-E 染色及病理学观察

给药结束后第3 天打开大鼠胸腔，夹闭右主支气管，经气管插管处以25 cm 汞柱的灌注压力向左主支气管内灌注4%多聚甲醛，近心端缝线结扎离断肺后浸于4%多聚甲醛48 h，之后梯度脱水、二甲苯透明，石蜡包埋。以5 μm 厚度切片，脱蜡，梯度水化，后行H-E 染色，二甲苯透明后中性树胶封片。高倍显微镜下用软件测量平均肺泡间隔、平均肺泡数，评估造模是否成功。

1.5 免疫印迹检测NF-κB 和Bcl-2 蛋白表达

分别提取4 组大鼠肺组织100 mg，将组织裂解，提取蛋白，测量蛋白浓度，分装后保存在-20℃冰箱。将蛋白溶液与缓冲溶液按4∶1 比例混匀，后煮沸、变性。在电泳板内分别注入50 μmol/L 的蛋白样品，把电泳后的样品转移至PVDF 膜上，加入脱脂奶粉封闭1 h。加入一抗后TTBS 漂洗10 min×3 次，加入二抗常温1 h。取出PVDF 膜，TTBS 漂洗10 min×3 次，DAB 显色后数码相机照相。

1.6 PMVEC 原代培养和鉴定

1.6.1 PMVEC 原代培养 麻醉大鼠，消毒后分离大鼠皮肤和肌肉组织，打开胸腔，暴露心肺，用夹子夹闭腔静脉，放出血液后把肺循环灌洗干净，再取出肺叶，放置在无血清培养基中培养。分离剔除脏层胸膜，剪下1 mm×1 mm×1 mm 大小的组织块均匀贴在培养瓶中，培养瓶中留有适量的培养液，把培养瓶倒置在恒温箱中进行孵育，4 h 后将瓶归位，以确保培养液和组织块恰好接触。60 h 后观察细胞从组织块的游出情况，而后把组织块移除，再加入培养液。当细胞融合达到80%～90%时，胰蛋白酶消化传代。

1.6.2 PMVEC 鉴定 在显微镜下观察细胞的形态改变，用相机进行拍照。取2 代细胞消化后用悬浮液接种于专用的盖玻片上，培养48 h 后进行鉴定：多聚甲醛固定细胞后，加入CD34 多克隆抗体，4℃孵育过夜，DAPI 染色5 min，PBS 溶液终止染色；25 μg/mL BSI 加入到细胞中，避光1 h，抗荧光淬灭剂对细胞进行封片。

1.7 MTT 法检测PMVEC 代谢活性

取对数期生长的PMVEC，用胰酶消化成细胞悬液，将其种植于96 孔板中，置于培养箱内培养5 h 后，弃去培养液，PBS 清洗3 遍，换内皮细胞培养基（endothelial cell medium，ECM）继续培养24 h，观察细胞生长状态良好，再换条件培养液培养24 h。根据实验要求将PMVEC 分别培养24 h及48 h。于实验终止4 h 前避光条件下加入浓度为5 mg/mL 的MTT 溶液，每孔 20 μL，然后置入培养箱中孵育至实验终止。取出细胞，吸去上清，每孔加入150 μL 的DMSO，溶解蓝色结晶，待结晶溶解后上机检测。

1.8 流式细胞仪检测PMVEC 凋亡率

将PMVEC 用0.25%胰酶消化制成密度为1×105/mL 的细胞液，PBS 冲洗2 次，换用ECM 培 养24 h 后移至离心管中，加入400 μL 1×Binding Buffer 缓冲液、5 μL 的Annexin V-FITC轻轻混匀后避光孵育15 min，加入10 μL 的碘化丙啶（PI），轻轻混匀后冰浴5 min，在30 min 内上流式细胞仪检测。

1.9 统计学处理

采用SPSS19.0 软件进行分析。计量资料数据以±s表示，组间比较采用t检验，多组计量数据比较采用单因素分析法检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠肺组织病理形态

空白组大鼠支气管、肺组织结构清晰、正常，可见完整的支气管黏膜上皮和大小均匀的肺泡（图1A）；烟雾组大鼠可见支气管壁和肺泡结构被破坏，支气管管腔结构变窄，可见炎症细胞浸润、黏性液分泌物，肺泡腔变大、壁薄；肺泡间隔变窄或中断，还可见肺大泡（图1B）；低、中、高剂量组的肺组织出现明显改善，且红景天苷高剂量组肺组织改善最为明显（图1C～1E）。

图1 各组大鼠肺组织结构。

2.2 大鼠肺泡数和肺泡间隔

和空白组比较，烟雾组大鼠肺泡数显著降低，肺泡间隔明显升高（P<0.05）；和模型组比较，红景天苷低、中、高剂量组大鼠肺泡数均显著升高，肺泡间隔均显著降低，其中高剂量组变化最为显著（P<0.05）（表1）。

表1 各组大鼠肺泡数和肺泡间隔比较（n=10，±s）

表1 各组大鼠肺泡数和肺泡间隔比较（n=10，±s）

*P<0.05 vs 空白组；△P<0.05 vs 烟雾组；#P<0.05 vs 低剂量组；□P<0.05 vs 中剂量组

组别 肺泡数（个/mm2） 肺泡间隔（μm）空白组 534.7±100.1 36.7±6.2烟雾组 318.4±41.2* 55.2±10.1*低剂量组 421.6±63.7*△ 50.4±8.5*△中剂量组 468.9±75.3*△# 46.3±7.6*△#高剂量组 500.4±83.6*△#□ 39.8±6.9*△#□

2.3 大鼠NF-κB 和Bcl-2 蛋白表达

和空白组比较，烟雾组大鼠肺组织NF-κB 蛋白表达显著升高，Bcl-2 蛋白表达明显降低（P<0.01）；和烟雾组比较，红景天苷低剂量组和高剂量组肺组织NF-κB 蛋白表达显著降低，Bcl-2 蛋白表达显著升高，且红景天苷高剂量组的变化最为显著（P<0.01）（图2）。

图2 各组大鼠NF-κB 和Bcl-2 蛋白表达比较。

2.4 大鼠原代PMVEC 的生长情况

60 h 后，可观察到细胞从肺组织块的边缘游出（图3A）；5～7 d 后可见细胞长成单层，呈铺路石样排列，形态为多角形或短梭型，且细胞大小均匀（图3B）。

2.5 PMVEC 免疫细胞化学鉴定

荧光显微镜下观察到PMVEC 细胞质内绿色荧光颗粒，CD34 阳性表达，证实培养的细胞为血管内皮细胞。与FITC 标记的植物凝集素BSI 的阳性结合，证实该细胞为微血管内皮细胞（图3C）。

图3 组织贴块法培养大鼠PMVEC。

2.6 大鼠PMVEC 活性

和空白组比较，烟雾组大鼠24 h 和48 h 的PMVEC 活性明显降低（P<0.01）；和烟雾组比较，红景天苷低、中、高剂量组大鼠的PMVEC 活性显著提升（P<0.01），且高剂量组大鼠PMVEC 活性明显高于低剂量组和中剂量组（P<0.05）（表2）。

表2 各组大鼠PMVEC 活性比较（n=10，±s）

表2 各组大鼠PMVEC 活性比较（n=10，±s）

*P<0.05 vs 空白组；△P<0.05 vs 烟雾组；#P<0.05 vs 红景天苷低剂量组；□P<0.05 vs 红景天苷中剂量组

组别 24 h 48 h空白组 1.01±0.11 1.52±0.22烟雾组 0.55±0.06* 0.37±0.05*红景天苷低剂量组 0.77±0.17*△ 0.96±0.19*△红景天苷中剂量组 0.83±0.18*△# 1.11±0.20*△#红景天苷高剂量组 0.95±0.19*△□# 1.22±0.21*△□#

2.7 大鼠PMVEC 的凋亡率

和空白组比较，烟雾组PMVEC 凋亡率显著增加（P<0.01），红景天苷低、中、高剂量组PMVEC凋亡率显著降低，且随着红景天苷剂量的增加，凋亡率降低更为显著（P<0.01）（图4、5）。

图4 流式细胞仪检测PMVEC 凋亡率散点图。

图5 大鼠PMVEC 细胞凋亡率比较

3 讨论

既往研究证明，长期吸烟可导致COPD 的发生[10]。香烟烟草中所含有的化学成分极其复杂，烟草在燃烧的过程中释放出烟雾，烟雾中的多种物质会导致炎症和癌症的发生，对机体的各个器官造成严重的损伤[11]。PMVEC 以紧密连接方式像地毯一样覆盖在肺血管腔表面，直接与血液接触，是构成“气血屏障”的基本结构，在生理和病理情况下都发挥着重要的作用[12]。PMVEC 及其紧密连接的蛋白对维持血管内壁完整性、调节血管通透性、防止凝血和血栓形成等起重要作用。PMVEC 的形态、功能和大血管起源的内皮细胞有很大不同，因此本研究体外培养烟雾暴露大鼠PMVEC，观察红景天苷对其细胞活性以及大鼠肺组织NF-κB 和Bcl-2 蛋白表达水平的影响。

烟雾所致肺气肿模型类似于人的小叶中心型肺气肿，这是香烟烟雾相关性 COPD 最常见的病理类型。本研究用不同剂量的红景天苷干预烟雾暴露大鼠，显示干预后大鼠的肺组织病理学形态得到明显改善。红景天是景天科红景天属草本或亚灌木植物，主要生长在高海拔的喜马拉雅山区、亚洲西部和北美洲等高寒地带，具有顽强的生命力和耐低氧等特性，被誉为“高原人参”。《本草纲目》记载红景天具有“去邪恶气，补诸不足”的功效，大量研究证明红景天苷具有保护神经元、肺组织等多种生物活性。张卓一等[13]研究显示，红景天苷可有效改善百草枯中毒大鼠的肺组织形态，其作用机制可能与调控Toll 样受体4 和NF-κB 的表达有关。本研究结果与上述报道一致。

红景天苷可以有效抗击抑郁和焦虑，并且对衰老、疲劳和氧化等都有一定的拮抗作用[14-15]。本研究采用常用的组织贴块法培养出大鼠PMVEC，实验结果显示红景天苷能有效提高PMVEC 活性，同时抑制PMVEC 凋亡率。郑明昱等[16]报道，模型组肺组织中转化生长因子-β1（TGF-β1） mRNA 和蛋白表达水平与对照组相比显著增高，而红景天苷组肺组织中TGF-β1 mRNA 和蛋白表达显著低于模型组，推测红景天苷对平滑肌增殖、气道上皮增生的抑制作用可能是通过下调TGF-β1 的表达而实现。康春燕等[17]研究表明，红景天苷可抑制模拟微重力诱导的PMVEC 凋亡，其机制可能是影响了PI3K/Akt 通路。Bcl-2 家族在细胞内的凋亡信号转导过程中起重要的作用，是重要的抗凋亡分子[18]。NF-κB 是Rel 蛋白家族的成员之一，广泛存在于各种细胞中，为重要的转录调控因子，与免疫应答，细胞增殖、生长及分化，细胞存活及凋亡均有密切关系[19]。有研究证实吸烟可以使肺组织NF-κB 的表达增强，本实验结果也显示烟雾组大鼠肺组织NF-κB 表达显著增加，Bcl-2 的表达明显降低；干预后的红景天苷低剂量和高剂量组大鼠NF-κB 表达均得到了显著抑制，明显增加了Bcl-2 的表达，但红景天苷高剂量组的蛋白表达改善最为明显。Recio 等[20]研究表明，红景天苷能够改善COPD 可能 与MAPK/NF-κB 通路相关。Chen 等[21]研究证实，红景天苷通过激活Nrf2 抗氧化信号通路及抑制NF-κB 和TGF-β1、Smad2/Smad3 通路发挥抗炎、抗氧化应激、抗纤维化效应。

综上所述，红景天苷可抑制烟雾暴露大鼠PMVEC 凋亡，其作用机制可能与抑制NF-κB 的活性、促进Bcl-2 表达有关。