miRNA-132通过Hedgehog信号通路对肝癌细胞凋亡的作用机制*

康助习 匡 黎 郭 俊 权瑞泉 魏 英

（国药东风总医院，1 肿瘤科，2 实验中心，十堰 442000）

大约有八成的肝癌患者体内的癌细胞已扩散至全身各器官组织中，因而无法通过手术进行根治[1-3]。同时，术后患者容易出现肝癌复发和转移，效果欠佳。目前对肝癌发病的分子机制仍然不清楚，有专家推测是多种原因共同导致[4-5]。大量研究表明，通过对肝癌分子发病机制的研究，进一步掌握与肝癌密切相关的信号通路来确定针对性的靶向性治疗方案，对于阻止患者病情恶化、增加肝癌患者存活率具有重大意义，因此寻找抗肝癌的新靶点刻不容缓。有研究显示[6-7]通过干预癌细胞的信号转导通路在一定程度上可以控制病情进展。Hedgehog（Hh）信号通路在研究中被发现与肿瘤的发生存在密切关系[8-10]。而miRNA-132 则被证实在多种人类肿瘤（如乳腺癌、肝癌等）中检验结果含量均较低，显示其具有抑癌基因的作用[11]。但是miRNA-132对Hh 信号作用的相关研究较少，目前尚不清楚。本研究以人肝癌HepG2 细胞为研究对象，探讨miRNA-132 通过Hh 信号通路对HepG2 细胞凋亡的作用机制。

1 材料和方法

1.1 细胞来源及分组

将在ATCC细胞库购买的人肝癌HepG2细胞分为空白组（无转染HepG2）、NC组（HepG2转染miR-132-NC）、YJ组（HepG2转染miR-132 mimics）。

1.2 实验仪器与试剂

电泳仪、PCR 仪（北京由莱普特科学仪器）；流式细胞仪（北京德利卡生物技术）；miR-132 mimics，miR-132-NC（上海生工）；Transwell小室（北京明阳科华生物科技）；CCK-8 试剂盒（Dojindo，日本）；PVDF 膜（Millipore，美国）；恒温摇床（成都苏净器材公司）。

1.3 细胞培养

在DMEM 培育液（含有胎牛血清）中培养HepG2 细胞株。细胞数量为80%～90%时，进行胰蛋白酶消化，然后采取1 600 r/min 进行离心5 min，收集、重悬并培养细胞。

1.4 细胞转染

取对数生长HepG2细胞，接种于6孔板内（1×104个/mL），22 h后，HepG2细胞融合度达到90%时，把4 μL脂质体和200 μL缓冲液依次加入EP管中，充分混和20 min后，加入6孔板，用Lipofectamine 2000转染试剂盒分别将miR-132 mimics、miR-132-NC转染至HepG2细胞，转染5 h后，继续培养，采用qRT-PCR法检测是否转染成功。

1.5 RT-PCR 检测miR-132 含量

将液氮冷冻的HepG2 细胞进行研磨，用TRIzol 进行总RNA 的提取，逆转录参照说明书执行，将逆转后所得的cDNA 进行荧光反应实验。所有反应严格按照反应的条件进行扩增，内参采用GAPDH，变性3 min 95℃，变性5 s 95℃，退火1 min 60℃，共40 个循环。取平均值计算Ct 值，计算方法用2－△△Ct法。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.6 CCK-8 法检测细胞增殖

将转染后的细胞稀释（1×105/mL），培养0.5 d。在96 孔板中平铺，数量增长到一定程度后加入CCK-8 10 μL。常温静置30 min，使用读板器检测450 nm OD 值。

1.7 流式细胞仪检测细胞凋亡

将HepG2 细胞密度调整至1.2×106/mL，接种于6 孔板中培养。0.01 mol/L PBS 洗涤，1 650 r/min 离心5min，-4 ℃保存，PBS 洗涤3 次，水浴，吹打均匀，4℃避光孵育30 min。流式细胞仪进行流式上样检测。

1.8 Transwell 小室检测细胞侵袭能力

各组HepG2 细胞接种数量为1×105/mL，将50 mg/mL 的基质胶稀释后加入小室上层，37℃下呈凝胶状态。上室中加入细胞悬液，下室中加入少量胎牛血清培养基，37.5℃培养24 h，取出小室，拭去膜上面的细胞，结晶紫染色，计算膜下面的细胞，即HepG2 侵袭细胞数。

1.9 免疫印迹检测Shh 蛋白表达

将HepG2 细胞进行裂解，并提取核蛋白，将提取出的蛋白溶液和缓冲溶液按4∶1 的比例混均，煮沸变性。电泳后的50 μL 蛋白样品转移至PVDF膜，加脱脂奶粉封闭，时长为1 h。加入1 抗后进行TTBS 漂洗，3×10 min，最后加入二抗，常温封闭1 h。取出PVDF 膜，进行TTBS 漂洗，DAB 显色后数码相机照相。

1.10 统计学处理

采用软件对空白组、NC 组、YJ 组HepG2 细胞凋亡情况及Shh 蛋白表达量等数据进行分析，空白组、NC 组、YJ 组比较采用单因素方差分析，两组比较采用t检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HepG2 细胞中miR-132 相对表达量

RT-PCR 检测结果显示（图1），3 组对比，YJ组HepG2 细胞中miR-132 表达量最高（P<0.05），说明转染成功。

图1 3 组HepG2 细胞中miR-132 表达量

2.2 各组HepG2 细胞增殖情况

CCK-8 检测结果显示，3 组对比，YJ 组HepG2细胞增殖数量最低（P<0.05），空白组HepG2 细胞的增殖与NC 组差异无统计意义（P>0.05），皆高于YJ 组（P<0.05）（图2）。

图2 3 组HepG2 细胞增殖情况

2.3 各组HepG2 细胞凋亡情况

流式细胞仪检测结果显示，YJ 组、NC组、空白组细胞凋亡率分别是23.07%±2.17%、3.39%±0.69%、3.32%±0.57%，与NC 组及空白组比较，YJ 组HepG2 细胞凋亡数量最多（均P<0.05），空白组细胞凋亡数量与NC 组对比差异无统计学意义（P>0.05）（图3）。

图3 流式细胞仪检测细胞凋亡

2.4 各组HepG2 细胞侵袭情况

Transwell 小室检测结果显示，YJ 组细胞侵袭数量（58.60±5.32）与空白组和NC 组比较明显降低（均P<0.05），NC 组细胞侵袭数量（95.32±9.32），与空白组（98.60±9.65））相比差异无统计学意义（P>0.05）（图4）。

图4 肝癌HepG2 细胞侵袭情况

2.5 各组Shh 蛋白相对表达量

免疫印迹检测结果显示，YJ 组Shh 蛋白相对表达量与空白组和NC 组相比明显降低（P<0.05），NC 组Shh 蛋白相对表达量含量与空白组差异无统计学意义（P>0.05）（图5）。

图5 3 组细胞中Shh 的蛋白相对表达量比较

3 讨论

在中国最新的一次流行病调查报告中显示，我国每年死于肝癌的人数约为43 万，5年内每1 万名患者中仅有3 千左右的患者得以存活[12]。该病与普通肝脏疾病区分困难，所以很多患者错过最佳治疗时期。病情进展迅猛，多数患者在确诊初期病情已发展到难以甚至无法控制的状态[13]。普通药物治疗成效微弱，目前临床还是依靠手术治疗来控制病情发展。虽取得了一定成效，但对于改善患者生存率，增加患者生存时间的意义不显著[14]。

miR-132 是在小鼠神经组织中发现的一种生物内源的非编码小RNA，定位在人类染色体17p13[15]。目前已经有研究显示，其在肿瘤的发生和进展中发挥一定作用，在多种人类肿瘤（如大肠癌、肝癌等）中检测含量较低，对癌细胞有抑制作用。杨波等[16]研究表明，miR-132 对于卵巢癌细胞的迁移和侵袭发挥抑制作用，表明miR-132很有可能是一种新的肿瘤抑制基因。为了深入探究miR-132 在人肝癌HepG2 细胞中的生物学作用，本研究通过过表达质粒miR-132 mimics 转染人肝癌HepG2 细胞，提升 miR-132 表达量。对空白组、NC 组、YJ 组人肝癌HepG2 细胞检测结果显示，与空白组及NC 组比较，YJ 组HepG2 细胞增殖数量最少，侵袭数量降低，细胞凋亡数量升高，结果说明miR-132 抑制HepG2 细胞增殖、侵袭，促进其凋亡。沙敏等[17]通过血清检测显示，血清miR-132在肝癌患者癌细胞中表达下降，其在肝癌的发生、发展及转移中均有参与并发挥重要的调节作用，并且能够通过靶向抑制GP73 的表达，降低GP73 活性发挥抑制肝癌增长作用。刘海斌等[18]通过转染miR-132 模拟物进行实验研究，结果显示过表达的miR-132 对体内外肝癌细胞有增殖抑制和凋亡诱导作用，miR-132 有望成为肝癌治疗的新靶点。

Hh 信号通路是果蝇发育中相对保守的信号通路，其在器官形成的胚胎发育阶段具有控制细胞生长与增殖、促进细胞分化的功能。近年来，研究表明该通路异常激活与多种肿瘤疾病（如胃癌、直肠癌等）的发生存在较大联系。沈依萌等[19]在其研究中显示正常成人体内 Hh 信号通路不表达或很少表达，但在肝癌组织中可见 Hh 信号通路的异常激活，进而导致其下游靶基因的表达出现异常情况，促进肝癌发生及发展过程。赵洪川等[20]研究显示Shh、Ptch 等Hh 信号通路基因在肝癌中表达量很高，提示Hh 信号通路在肝癌的发生和进展进程中存在异常激活的可能性，为肝癌的发病机制研究提供了新的思考方向。姚利等[21]研究表明 Shh蛋白表达在基因转录、肿瘤的发生发展等方面发挥了重大作用，其与肿瘤的高增殖活性密切相关。研究证实许多组织器官肿瘤的形成都与该基因异常表达有关。Shh 蛋白含量升高导致其与Ptch 蛋白结合，大量的Smo 蛋白从Ptch 蛋白中解脱后进入细胞核，激活了下游转录因子Gli，引发促细胞生长基因过度表达，进而导致细胞增殖。相反，当该蛋白表达被抑制时可发挥促凋亡作用。Hh 信号通路的异常表达可能在肝癌的发生发展中起到了直接或间接作用。近年来越来越多的研究发现Hh 通路的异常激活及miRNA 的表达变化在各类肿瘤中同时存在。Guo 等[22]在研究中探讨了Glil 基因在肝癌中的表达情况及其与miR-132 表达量之间的相关性，通过实验表明两者在肝癌中可能具有协同作用。同时显示miR-132 在肝癌中呈现低表达，并通过靶向抑制下游的转录调节因子Glil 基因参与调控发现Hh 信号通路，发挥类似抑癌基因作用，能够抑制肝癌细胞增殖并诱导其凋亡。Li 等[23]通过荧光素酶报道基因实验验证了miR-132 与Hh 配体Shh 之间的相互作用关系，实验显示miR-132 上调可以抑制Shh的表达，从而抑制肝癌细胞的增殖过程，诱导肝癌细胞凋亡。以上研究结果均揭示miR-132 与Hh 的相互关联影响了肝癌发生发展过程。本研究结果显示，YJ 组HepG2 细胞中Shh 蛋白表达量最低，与NC 组、空白组相比差距大，NC 组与空白组相比数据接近，提示过表达miR-132 后，Shh 蛋白表达量减少，发挥促凋亡作用。说明Shh 蛋白有可能成为肝癌的诊断标志物之一，为恶性肿瘤的靶向治疗提供行之有效的靶点。

综上所述，miR-132 能够通过降低Hh 信号通路的表达水平发挥促人肝癌HepG2 细胞凋亡作用。