LncRNA SNHG15对子宫内膜癌细胞增殖及去集蛋白-金属蛋白酶17表达的影响

王秋宇 朱军义 许 静 郭 哲 孙慧霞 姜 平

（南阳市中心医院 南阳 473000）

子宫内膜癌是雌性激素及非雄性激素诱导的疾病。以往研究显示，人体子宫内膜属于动态结构的组织，当发病癌变时，癌细胞能够快速侵袭周旁组织，产生新肿瘤病灶[1]。子宫内膜癌具体的发病机制仍不清楚，寻找致癌基因及有效靶向治疗方法对于揭示子宫内膜癌发生发展具有重要作用[2]。小核仁RNA宿主基因15（small nucleolar RNA host gene 15，lncRNA SNHG15）属于lncRNA，位于人体染色体7p13，包含百余个转录本，在胃癌、肺癌等恶性肿瘤中表达显著升高，通过调节多种信号通路介导细胞迁移等生物活性[3]。去集蛋白-金属蛋白酶17（adisintegrin and metalloproteinase 17，ADAM17）是近年新发现的多功能的的表面糖蛋白，通过EGFR-PI3K-Akt 途径促进癌细胞增殖及迁移[4]。LncRNA SNHG15 在子宫内膜癌中研究机制暂无报道。本研究探讨lncRNA SNHG15 对子宫内膜癌细胞的作用及对ADAM17 基因的影响。

1 材料和方法

1.1 子宫内膜癌组织样本收集

选择2018年12月～2019年12月南阳市中心医院通过病理确诊，经外科手术的12 例子宫内膜癌患者组织及癌旁3 cm 的正常组织。患者外科手术前均未接受化学治疗，组织存于液氮中保存。本研究通过医院伦理委员会规定，并取得患者同意。

1.2 PCR 检测子宫内膜癌组织中及细胞中lncRNA SNHG15 水平

利用TRIzol 法检测子宫内膜癌组织及癌旁组织和细胞中总RNA，利用PrimeScript cDNA 转录合成cDNA，获得反体系，进行荧光定量PCR 反应，以GAPDH 为内参，根据Ct 值计算子宫内膜癌组织 中lncRNA SNHG15 水 平，lncRNA SNHG15 上游引物序列为5'-CCTAGTGAGGAGTGGAGCTG A-3'，下游引物序列为5'-CTCATTCTGGAAGCAG AGAACC-3'；内参GAPDH 上游引物序列为5'-GTC GGTGTGAACGGATTTG-3'，下游引物序列为5'-AAGATGGTGATGGGCTTCC-3'，用2-△△Ct法计量表达量。

1.3 细胞株、主要试剂

Ishikawa细胞及RPMI1640培养基（上海一基实业）；Lipofectamine 2000 （美国 Thermofisher 公司）；lncRNA SNHG15-siRNA及对照物NC-siRNA（上海吉玛生物）；兔抗人ADAM17多克隆抗体（北京来福赛思科技生物）；CCK-8（上海慧颖生物科技）。

1.4 细胞培养

将低温冷藏的Ishikawa 细胞，快速移入37℃水中溶解，离心后，离弃上清液，加入培养基，5%CO237.5℃培养，贴壁生长，1～2 d 更换新的培养液。细胞生长到90%时，加入蛋白液消化，传代保存，以备后用。

1.5 细胞转染及分组

将5×103个的细胞平铺到16 孔板中，按照Lipofectamine 2000 说明书进行转染，分别将lncRNA SNHG15-siRNA 及NC-siRNA 转染到Ishikawa 细胞中，37.5 ℃，5%CO2继续培养。分为EC 组、NC 组及实验组，EC 组为无干预的Ishikawa 细胞，NC 组为Ishikawa 细胞转染lncRNA SNHG15si-NC，实验组为Ishikawa 细胞转染lncRNA SNHG15-siRNA。将数量为1×104个 的Ishikawa 细胞接种到96 孔中，15 h 后，待Ishikawa细胞重复融合，在EP 管中放入200 μL 转染液体和4 μL 脂质体，后加入5 μg 的lncRNA SNHG15-siRNA，充分混合后，转染9 h 后，用含血清、双抗的培养液继续培养。

1.6 CCK-8 检测Ishikawa 细胞活力

各组Ishikawa 细胞加入蛋白酶消化，按照数量5×103接种到96 孔板中，每孔200 μL，置于37.5℃，5%CO2培养，每组设置6 孔，培养0、24、48 h 及72 h 后，加入100 μL 10%的CCK-8 培养基，37.5℃，5%CO2下培养3 h，酶标仪450 nm 下计算细胞活力，计算公式细胞活力（%）=实验组450 nm 吸光度/对照组450 nm 吸光度×100%.

1.7 Transwell 小室检测Ishikawa 细胞侵袭能力

50 mg/L 的基质胶稀释后加入小室上层，37℃下呈凝胶状态，Ishikawa 细胞数目为1×105/mL，上室中加入细胞悬液，下室中加入少量胎牛血清培养基，拭去残留细胞，0.1%结晶紫染色，计算Ishikawa 细胞侵袭的数量。

1.8 流式细胞仪检测Ishikawa 细胞凋亡

对数生长的Ishikawa 细胞加入PBS 溶液中，予以洗涤，再离心，5 min，运用100 μL 结合缓冲液，对细胞进行重悬，用 5 μL 标记FITC 的Annexin Ⅴ与5 μL PI 染色混匀，无光条件下，孵育15 min 后注入400 μL 结合缓冲液混匀，予以洗涤，次数3 次，记录细胞凋亡情况。

1.9 免疫印迹检测兔抗人ADAMl7 蛋白水平

取对数生长Ishikawa 细胞，胰蛋白酶消化，高速离心后，保留血清样本。进行电泳，PVDF 膜TBS 浸泡10 min，反复PBS 冲洗，每次5 min，分别加入兔抗人单克隆抗体兔抗人ADAM17、GAPDH 抗体（1∶500 ）、过氧化物酶标记二抗（1∶2 000），分别杂交，PBS 冲洗。后将膜浸入ECL 工作液，随后进行检测，获取图像。

1.10 统计学处理

采用SPSS 23.0 软件对数据进行分析，子宫内膜癌组织及癌旁组织中lncRNA SNHG15 水平，Ishikawa 细胞活性、凋亡、侵袭及ADAM17 蛋白水平指标结果采用±s表示，组间比较用t检验，3 组间比较采用方差分析，P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 子宫内膜癌组织及癌旁组织中lncRNA SNHG15水平

lncRNA SNHG15 在子宫内膜癌癌旁组织和癌组织的表达量分别为1.00±0.06、2.15±0.23，在子宫内膜癌组织中水平显著高于癌旁组织（P<0.05）。

2.2 各组Ishikawa 中lncRNA SNHG15 水平

EC 组、NC 组及实验组中lncRNA SNHG15 水平分别为1.00±0.00、0.98±0.03 和0.52±0.09，实验组中lncRNA SNHG15 显著低于EC 组和NC组，差异有统计学意义（P<0.05），说明转染成功。

2.3 各组Ishikawa 细胞活力

CCK-8 检测结果显示，0、24、48、72 h 时，EC 组及NC 组Ishikawa 细胞活力OD 值比较均无差异（P>0.05）；24、48、72 h 时，实验组与EC 组相比，Ishikawa 细胞活力OD 值明显降低（P<0.05），表明敲低lncRNA SNHG15 能够抑制Ishikawa 细胞活力（表1）。

表1 各组Ishikawa 细胞活力OD 值（±s）

表1 各组Ishikawa 细胞活力OD 值（±s）

*P<0.05 vs EC 组；#P<0.05 vs NC 组

组别 0 h 24 h 48 h 72 h EC 组 0.500±0.06 0.889±0.100 1.204±0.200 1.673±0.160 NC 组 0.497±0.08 0.880±0.012 1.150±0.220 1.650±0.180实验组 0.503±0.04 0.614±0.070*# 0.771±0.090*# 0.997±0.150*#

2.4 各组Ishikawa 细胞侵袭数目

Transwell 小室检测结果显示，EC 组，NC 组及实验组Ishikawa 细胞侵袭数分别为（79.67±8.79）个，（76.02±9.30）个及（33.26±4.30）个，3 组比较差异有统计学意义（P<0.05），EC 组与NC 组侵袭数相比差异无统计学意义（P>0.05），实验组Ishikawa 细胞侵袭数目低于EC 组及NC 组（P<0.05）（图1）。

图1 各组Ishikawa 细胞侵袭数目。A：EC 组；B：NC 组；C：实验组.

2.5 Ishikawa 细胞凋亡率

流式细胞仪检测结果显示，EC 组、NC 组及实验组细胞凋亡率分别（5.32±1.23）%、（6.21±1.15）%及（19.06±2.40）%，3 组比较差异有统计学意义（P<0.05），EC 组与NC 组细胞凋亡率相比差异无统计学意义（P>0.05），实验组Ishikawa 细胞凋亡率高于EC 组及NC 组（P<0.05）（图2）。

图2 各组Ishikawa 细胞凋亡率。A：EC 组；B：NC 组；C：实验组.

2.6 ADAM17 蛋白表达量

免疫印迹检测结果显示，EC 组、NC 组及实验组子宫内膜癌中ADAM17 蛋白表达水平分别为1.00±0.12、0.97±0.15 及0.47±0.08，3 组间比较差异有统计学意义（P<0.05），EC 组与NC 组ADAM17 蛋白表达相比差异无统计学意义（P>0.05），实验组ADAM17 蛋白表达低于EC 组及NC组（P<0.05）（图3）。

图3 各组ADAM17 蛋白电泳图

3 讨论

LncRNA 是由聚合酶Ⅱ转录产生的长链非编码RNA，无翻译蛋白质作用，但对蛋白质翻译后修饰等作用具有影响。随着基因工程技术的问世，发现LncRNA 与多种疾病病理改变具有相关性[6-7]。lncRNA SNHG15 属于lncRNA 其中之一，以往研究表明能够对胶质瘤及甲状腺癌细胞具有加快增殖的作用，但是对子宫内膜癌细胞的影响暂未见文献报道。因此，本研究通过体外培养子宫内膜癌细胞转染lncRNA SNHG15-siRNA 观察其细胞活性，并探讨其发生机制。

本研究通过收集本院外科手术切除子宫内膜癌组织及癌旁组织，通过PCR 检测显示，在子宫内膜癌组织中lncRNA SNHG15 表达显著高于癌旁组织，说明lncRNA SNHG15 表达升高与子宫内膜癌患者癌细胞发生侵袭及转移相关。LncRNA SNHG15 是一个被公认的lncRNA，染色体体7p13，包含837bp 转录本，是多种恶性肿瘤中潜在的分子标志物[9]。LncRNA SNHG15 在不同恶性肿瘤中发挥的作用存在差异，其产生与多因素、多基因及多通路相关[10]。LncRNA SNHG15 具有调节癌细胞生长及凋亡的能力[11]。在胶质瘤细胞中，转染lncRNA SNHG15 模拟物能够通过抑制miR-153 加快细胞迁移，当敲低lncRNA SNHG15 后miR-153水平升高，表示lncRNA SNHG15 能够增加胶质瘤细胞活性与特异性结合血管内皮生长因子（VEGF）因子相关，加快肿瘤血管生长，恶化病情。在结肠癌细胞中敲低lncRNA SNHG15 能够加快线粒体凋亡途径，增加胃癌细胞凋亡的同时，具有抑制炎症因子等作用[12]。在EC 中敲低lncRNA SNHG15，细胞增殖能力减弱，凋亡加剧，结果提示lncRNA SNHG15 与EC 增殖及侵袭密不可分，能够通过多种信号调节子宫内膜癌基因。

ADAM17 是ADAM 超家族成员之一，位于人体染色体2p25，由824 个氨基酸组成，主要以非活化酶原形式存在，当受到外界刺激时，能够产生EGFR 配体，通过生长因子介导EGFR 水平升高，发挥介导肿瘤细胞恶性侵袭、肿瘤血管生成等作用[13-14]。子宫内膜癌侵袭生理活动较强，可以发生肿瘤远处转移，其中肿瘤细胞粘连、基质内增殖等贯穿了整个侵袭的过程。ADAM 与肿瘤发生发展的关系已有众多文献，但是与子宫内膜癌之间的关系研究较少。子宫内膜癌发生发展机制首先是癌细胞之间黏附能力降低，减少接触性抑制，后发生远处转移，ADAM17 在其中发挥重要作用，肿瘤细胞生成的重要基础物质例如血管生成因子等均是ADAM17 重要底物，ADAM17 能够减除细胞间的黏性作用，为子宫内膜癌发展发挥促进作用[15]。杨洁玉[16]研究表示，在EC 组织中ADAM17 呈现强阳性表达，显著高于子宫内膜增生组织中ADAM17的水平，显示其水平高低能够直接反映子宫内膜癌病理分期及是否发生肌层浸润等[17]。本研究结果显示，实验组EC通过敲低lncRNA SNHG15后免疫印迹检测ADAM17水平显著低于NC组及内膜癌组，说明敲低lncRNA SNHG15能够抑制ADAM17表达，其机制可能在于抑制lncRNA SNHG15表达水平能够降低子宫内膜癌血管生成，减少VEGF水平，间接抑制ADAM17活性[18]。在以往研究中[7]，肝癌细胞的ADAM17能够诱导TNF-α介导VEGF水平升高，活性肝癌细胞活性，加快侵袭，恶化病情，敲低lncRNA SNHG15水平能够下调VEGF，从而改善肿瘤发生发展。LncRNA SNHG15降低后能够改变子宫内膜癌细胞生物活性的机制也可能与调节线粒体信号通路相关，相关研究发现si-lncRNA SNHG15可下调Bcl-2和caspase-3表达水平，上调Bax、c-caspase3和Cyt-C表达水平，而同时抑制lncRNA SNHG15和miR-153表达可减弱抑制lncRNA SNHG15对Bcl-2、caspase-3、Bax、c-caspase3和Cyt-C 表达影响，提示lncRNA SNHG15调控miR-153对乳腺癌细胞凋亡影响可能是通过线粒体途径实现的[19]。

本研究也有一定的不足，由于成本、时间等问题，未进行RNA 测序及生物信息学分析ADAM17包含的主要信号通路，可能产生的结果有一定偏差，存在局限性，在今后的研究中应加入更多的实验方法为子宫内膜癌的治疗提供更有力的实验依据。综上所述，敲低lncRNA SNHG15 能够抑制子宫内膜癌细胞增殖及侵袭，凋亡加剧，作用机制可能与降低ADAM17 水平相关。