盐酸曲美他嗪纳米乳的制备及其对缺血缺氧型 心肌细胞的保护作用

刁中极，平洋，雷锐，虞德忱，殷实，王伟（.佳木斯市中心医院，黑龙江 佳木斯 5400；.佳木斯大学药学院，黑龙江 佳木斯 54007）

缺血性心血管疾病是临床常见病和多发病，大量的循证医学数据表明，心血管疾病的治疗药物主要是通过改善局部缺血心肌的氧供需平衡，间接发挥心肌保护作用，但治疗后仍有患者留有心力衰竭的症状或体征[1]。因此合理优化心肌能量代谢受到了广大医务工作者的推荐。曲美他嗪作为一种改善能量代谢的新药，因其独特的作用机制及效果，在临床中越来越受到重视。由于其能减轻心肌细胞酸中毒和细胞内Na＋、Ca2＋超载，抑制氧自由基生成，稳定线粒体膜功能状态[2]，其临床应用已从单纯稳定型心绞痛扩展到对多种心肌缺血及心功能障碍的保护治疗。盐酸曲美他嗪在临床上的使用剂型为口服普通片剂、缓释片剂和胶囊剂[3-4]，以固体制剂形式的给药方式，难免会影响药物的体内吸收，本研究通过药剂学方法和手段，将盐酸曲美他嗪制备成W/O型口服纳米乳剂。纳米乳具有较小粒径，分散均匀度高，药物分散度高，能提高药物作用效果，同时对药物透皮吸收也有促进作用。盐酸曲美他嗪纳米乳剂的研究将为曲美他嗪新剂型开发提供研究基础。

1 仪器及试药

FA2004N电子分析天平（上海恒平科学仪器）；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器）；JY92-2D超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物仪器）；MALVERN Zetasizer Nano ZS粒径分析仪（英国马尔文仪器）；透射电子显微镜（日本株式会社仪器）；Agilent高效液相色谱仪工作站（日本岛津仪器）；371型-CO2培养箱（美国Thermo仪器）；TECAN sunrise光吸收酶标仪（瑞士帝肯仪器）；TGL-16GB台式高速离心机（上海安亭科学仪器）；KQ-200KDB型高功率数控超声波清洗器（昆山市超声仪器）；SZ93-1自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器）；Innoval ODS-2 C18色谱柱（博纳艾杰尔仪器）。

盐酸曲美他嗪（批号：Lot#E1905020，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；1，2-丙二醇（天津市大茂化学试剂厂）；脂肪酸山梨坦80（Span-80）、聚乙二醇400（PEG-400）（上海山浦化工有限公司）；聚氧乙烯40氢化蓖麻油（RH 40）、大豆磷脂（PC）、肉豆蔻酸异丙酯（IPM）、辛葵酸甘油酯（GTCC）、聚山梨酯-80（Tween-80）、液体石蜡、1-庚烷磺酸钠（上海麦克林生化科技有限公司）；大豆油（九三粮油工业集团有限公司）；单硬脂酸甘油酯（江苏伯业生物科技有限公司）；无水乙醇（天津市凯通化学试剂有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；H9c2 大鼠心肌细胞（中国科学院上海细胞库）；CCK-8试剂盒（日本同仁化学研究所）；DMEM 高糖培养基、胎牛血清、0.25%胰酶、PBS（Hyclone）；肌酸激酶同工酶（CKMB）试剂盒（上海酶联生物技术有限公司，批号：20191013）、超氧化物歧化酶（SOD、批号：20191103）和丙二醛（MDA、批号：20191104）试剂盒（北京天根生化科技有限公司）。

2 方法与结果

2.1 处方中各组分筛选

2.1.1 乳化剂的筛选 拟对PC、Span-80、RH 40、单硬脂酸甘油酯作为乳化剂筛选，基于文献方法[5]，采用丙二醇为助乳化剂，IPM为油相，乳化剂∶助乳化剂∶油相按1∶1∶2（质量比）称取并混合，置于恒温磁力搅拌器中，待形成透明溶液时缓慢滴加蒸馏水进行乳化。以乳剂外观状态为指标，进行乳化剂筛选。

2.1.2 助乳化剂的筛选 拟对PEG-400、Tween-80、无水乙醇与丙二醇作为助乳化剂筛选。分别按1∶1的比例与PC混合，将混合溶液按1∶1的比例与IPM混合，制备方法同上。以乳剂外观状态进行助乳化剂筛选。

2.1.3 油相的筛选 拟对IPM、GTCC、液体石蜡以及大豆油作为油相筛选，助乳化剂丙二醇和无水乙醇分别与乳化剂PC按1∶1的比例进行混合，再将混合溶液按1∶1的比例依次与上述的油相混合。以乳剂外观状态及过微孔滤膜阻力大小为指标，对油相进行筛选。

2.1.4 乳化剂与助乳化剂质量比的筛选 乳化剂与助乳化剂的质量比（Km）可以反映二者配比关系对纳米乳形成的影响。固定PC/丙二醇/IPM/水纳米乳体系[6]，将PC与丙二醇以Km为1∶1、1∶2、2∶1、3∶1、3∶2与4∶1进行混合，恒温磁力搅拌一段时间，使成透明溶液后，缓慢滴加蒸馏水，形成空白纳米乳。以乳剂外观状态及过膜阻力为指标确定PC与丙二醇的Km。

2.1.5 伪三元相图确定乳化区域 将PC与丙二醇以固定比例Km3∶2置于烧杯中，再将混合溶液与油相按1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1混合均匀，于52℃恒温磁力搅拌至全溶，向溶液体系中滴加蒸馏水，待体系由澄清变浑浊时记录双蒸水用量[7-9]，采用origin 9.0软件绘制伪三元相图。

2.1.6 复合乳剂的筛选 为得到预期粒径的纳米乳溶液，拟采用复合乳化剂[10-13]，即调整混合乳化剂的亲水亲油平衡值（HLB），增加乳化膜的稳固性。以Tween-80和PC作为复合乳化剂，基于处方（用量比）PC∶丙二醇∶IPM∶盐酸曲美他嗪水溶液＝5∶3.43∶33.83∶9。将PC与Tween-80以5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1混合制备纳米乳，以乳剂形成状态、形成纳米乳时的温度区间、超声分散后乳剂的外观、过微孔滤膜阻力以及粒径为考察指标，对复合乳化剂进行筛选。

2.2 盐酸曲美他嗪纳米乳的制备

精密称取PC 1.20 g、Tween-80 0.3 g、丙二醇1.03 g、IPM 10.15 g置于烧杯中，于52℃下恒温磁力搅拌至PC全溶，再称取盐酸曲美他嗪原料药100 mg于2.6 g双蒸水中，搅拌使其溶解，于室温下缓慢地向上述混合体系中滴加盐酸曲美他嗪溶液直至体系变为透明状均匀液体，将溶液置于冰水浴条件下，功率为70%，超声分散7 min，即得盐酸曲美他嗪纳米乳。

2.3 盐酸曲美他嗪纳米乳的表征

2.3.1 丁达尔现象 按“2.2”项下方法制备纳米乳，采用外激光照射方式，观察盐酸曲美他嗪纳米乳。

2.3.2 纳米乳剂类型鉴别 分别取两份盐酸曲美他嗪纳米乳1.5 mL置于离心管中，向两离心管中分别滴加苏丹红Ⅲ和亚甲基蓝染色剂，静止放置，观察两种染色剂在乳液中的扩散程度，以确定纳米乳剂类型[14]。

2.3.3 纳米乳外观形态观察 取盐酸曲美他嗪纳米乳1 mL，加入IPM溶液按体积比1∶10进行稀释，待测样品滴于超薄碳膜上，待自然挥干后，于透射电子显微镜（TEM）下观察外观形态。

2.3.4 粒径及zeta电位 取盐酸曲美他嗪纳米乳，分别置于石英比色皿和电位检测池中，采用马尔文激光粒度仪测定纳米乳的粒径与zeta电位。

2.4 盐酸曲美他嗪纳米乳的检测

2.4.1 色谱条件 流动相：1-庚烷磺酸钠溶液（1-庚烷磺酸钠1.8383 g，纯净水配制，磷酸调节pH 2.55）-乙腈-甲醇＝645∶316∶39；色谱柱：Innoval ODS-2（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1 mL·min－1；紫外检测波长：231 nm；柱温：25℃；进样量：10 μL。

2.4.2 对照品溶液的制备 精密称取盐酸曲美他嗪对照品500 mg，甲醇溶解并定容于100 mL 量瓶中，即得质量浓度为5.0 mg·mL－1的盐酸曲美他嗪对照品溶液，备用。

2.4.3 空白纳米乳样品的制备和测定 精密吸取空白纳米乳1 mL，加入10 mL甲醇溶液破乳，于8000 r·min－1离心15 min，取1 mL上清液于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，即得空白纳米乳样品；待测样品过0.22 μm滤膜，进样检测。

2.4.4 含量测定 精密量取盐酸曲美他嗪纳米乳1 mL，按“2.4.3”项下方法处理，即得盐酸曲美他嗪纳米乳待测样品，过0.22 μm滤膜，进样检测。

2.5 H9c2 心肌细胞保护作用

2.5.1 H9c2心肌细胞培养及分组 大鼠 H9c2 心肌细胞于 DMEM 高糖培养基（含10% FBS、1%双抗）中，37℃、5% CO2恒温培养箱中静置培养。正常组用完全培养基于培养箱中继续培养；模型组用完全培养基培养1 h 后更换为无糖无血清的DMEM 培养基，密闭培养。给药组以含药培养基培养，1 h 后更换为无糖无血清的DMEM 培养基，密闭培养。

2.5.2 CCK-8法检测 H9c2 心肌细胞存活率 取对数生长期H9c2 心肌细胞按1×105个·mL－1，接种于96孔板内，每个浓度设定3个复孔，于5%CO2培养箱中正常培养，每孔加入不同浓度的纳米乳溶液，对照组加等量培养液，继续培养12、24、48 h后每孔加入 CCK-8 溶液于5%CO2培养箱培养，酶标仪450 nm测定各孔的吸光度值，并计算各组对H9c2细胞的生长抑制率。

2.5.3 比色法检测LDH含量及心肌细胞内 CKMB、SOD、MDA 含量 取出上述细胞培养液，按照试剂盒说明书检测细胞培养液中的 LDH 含量及细胞内 CK-MB、SOD、MDA的含量[15-16]。

2.6 数据处理

采用SPSS 13.0软件进行统计，数据以（±s）表示，进行正态分布、方差齐性检验，各组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 处方各组分筛选结果

3.1.1 乳化剂的筛选结果 结果见表1所示，由乳剂外观结果最终确定乳化剂为PC。

表1 乳化剂筛选结果 Tab 1 Screening of emulsifiers

3.1.2 助乳化剂的筛选结果 结果如表2所示，由乳剂外观可知，无水乙醇和丙二醇均能得到外观澄清透明的纳米乳溶液，故进一步进行筛选。

表2 助乳化剂的筛选结果 Tab 2 Screening of co-emulsifier

3.1.3 油相的筛选结果 结果如表3所示，通过对油相的筛选，确定了助乳化剂为丙二醇，而油相筛选结果中IPM和GTCC均能得到较理想的乳剂，由于GTCC价格较贵，最终确定IPM为油相。

表3 油相筛选的结果 Tab 3 Screening of the oil phase

3.1.4 乳化剂与助乳化剂质量比的筛选结果 由表4可知，乳化剂与助乳化剂的Km比为3∶2时，能够满足各项筛选结果。

表4 Km的筛选结果 Tab 4 Screening of the Km

3.1.5 伪三元相图确定乳化区域 如表5所示，当混合溶液体系由澄清变混浊时纳米乳中各部分所占质量百分比，通过绘制伪三元相图初步确定盐酸曲美他嗪纳米乳的乳化区域（见图1），用于进一步优化盐酸曲美他嗪纳米乳中各相处方所占比例见表6。

图1 PC/Propylene glycol/IPM/双蒸水体系伪三元相图Fig 1 Pseudo ternary phase diagram of PC/Propylene glycol/IPM/double distilled water system

表5 乳化区域 Tab 5 Emulsification area

各组中NE1组与其余3组相比，水相含量高，纳米乳粒径值较小，PDI值最小，表明该处方液滴的分散性较好，流动性好。因此盐酸曲美他嗪纳米乳处方为乳化剂-助乳化剂∶油相∶水相＝5∶20∶4， 其中乳化剂∶助乳化剂为3∶2，见表6。

表6 纳米乳的组成、粒径及分散性 Tab 6 Composition，particle size and dispersibility of nanoemulsion

3.1.6 复合乳化剂的筛选结果 复合乳化剂筛选结果见表7，PC∶Tween-80＝4∶1时，制备的纳米乳粒径值较为理想，且该处方在后续冷藏（4℃）的条件下，乳液未出现油水分层，沉淀析出，因此确定盐酸曲美他嗪纳米乳的最终处方W%为复合乳化剂-助乳化剂：油相∶水相＝5∶20∶4，其中复合乳化剂∶助乳化剂＝3∶2，复合乳化剂为PC∶Tween 80＝4∶1。

表7 复合乳化剂的筛选结果 Tab 7 Screening of compound emulsifier

3.2 盐酸曲美他嗪纳米乳的表征

3.2.1 丁达尔现象 制备的纳米乳，外观为金黄色澄清透明的均一液体，用激光光束照射纳米乳时，出现一束明显的红色光柱，即产生丁达尔效应，证明制备的纳米乳属于胶体溶液，结果见图2。

图2 盐酸曲美他嗪纳米乳的丁达尔效应Fig 2 Tyndall effect of trimetazidine hydrochloride nanoemulsion

3.2.2 纳米乳类型鉴别结果 由图3可见油溶性染色剂扩散程度要比水溶性染色剂扩散速度快，且分布均匀，故可判断制备的盐酸曲美他嗪纳米乳为W/O型[14]。

图3 纳米乳的类型鉴别Fig 3 Types of nanoemulsion

3.2.3 纳米乳外观形态观察结果 如图4所示，在TEM中可观察到盐酸曲美他嗪纳米乳的外观形态为均一大小、分布均匀的类圆形乳滴粒子。

图4 盐酸曲美他嗪纳米乳TEM图Fig 4 TEM image of trimetazidine hydrochloride nanoemulsion

3.2.4 粒径及zeta电位 盐酸曲美他嗪纳米乳的粒径值为（161.97±1.20）nm，PDI为0.224，zeta电位值为－0.328 mV，见图5～6。

图5 盐酸曲美他嗪纳米乳粒径分布图Fig 5 Distribution of trimetazidine hydrochloride nanoemulsion particle sizes

图6 盐酸曲美他嗪纳米乳zeta 电位图Fig 6 Zeta potential of trimetazidine hydrochloride nanoemulsion

3.2.5 专属性考察 由图7可知，供试品溶液的药物的保留时间与对照品一致tR＝8.103 min，而且空白样品对盐酸曲美他嗪的测定无干扰，分析方法的专属性良好。

图7 HPLC 色谱图Fig 7 HPLC chromatogram

3.2.6 盐酸曲美他嗪纳米乳含量测定 测得纳米乳中盐酸曲美他嗪的含量为4.17 mg·mL－1。

3.3 缺血缺氧型心肌细胞的保护作用研究

3.3.1 CCK-8法检测H9c2细胞存活率 结果如表8所示，模型组与正常组比较差异有统计学意义（P＜0.01），说明缺血缺氧型心肌细胞模型建立成功；各浓度治疗组与模型组比较H9c2细胞存活率明显升高（P＜0.01），并表现出浓度依赖性。

表8 H9c2细胞存活率(±s，n＝3) Tab 8 Survival rate of H9c2 cells (±s，n＝3)

表8 H9c2细胞存活率(±s，n＝3) Tab 8 Survival rate of H9c2 cells (±s，n＝3)

注：与正常组比较，*P＜0.01；与模型组比较，# P＜0.01。Note：Compare with the normal group，*P＜0.01；compared with the model group，#P＜0.01.

组别 剂量/（mg·mL－1） OD值 存活率/%正常组 － 0.2013±0.0020 100.00模型组 － 0.1104±0.0035* 43.96治疗组1 0.0045 0.1387±0.0027*# 61.41治疗组2 0.045 0.1428±0.0012*# 63.93治疗组3 0.45 0.1691±0.0021*# 80.15

3.3.2 LDH、CK-MB、SOD及MDA含量 结果如表9所示，与正常组比较，模型组H9c2细胞培养液中LDH含量显著增高（P＜0.01）；CKMB、MDA含量显著升高，SOD含量显著降低（P＜0.01）与模型组比较，各治疗组H9c2细胞培养液中LDH含量明显降低（P＜0.01）。各治疗组CK-MB、MDA含量均有不同程度降低（P＜0.01），SOD含量升高（P＜0.01）。

表9 H9c2 心肌细胞培养液中 LDH及细胞内相关生化指标含量(x±s，n＝3) Tab 9 Content of LDH and related biochemical indexes in H9c2 cells (x±s，n＝3)

4 讨论

缺血性心血管疾病可引起心肌缺氧，心肌细胞能量代谢紊乱。盐酸曲美他嗪通过调节心肌代谢底物，改善能量代谢及心肌缺血，加强心脏功能。现代药理学研究表明，CK-MB 为主要存在于心肌中的肌酸激酶同工酶，当心肌发生急性损伤时会大量释放，具有较高的特异性，可以作为判断心肌损伤程度的依据[17-18]。SOD和MDA均与氧化应激密切相关，两者可通过减少脂质过氧化物产生、增加抗氧化物酶的活性而减少氧化应激，抑制细胞凋亡，进而提高细胞存活率，保护心肌细胞[19]。本研究制备的盐酸曲美他嗪纳米乳剂制备方法简单易于操作，对H9c2 心肌细胞有一定的保护作用，且制备的纳米乳剂为W/O型，可增加药物的脂溶性，进一步改善药物的体内跨膜转运效率，为其体内药动学和药理学研究提供研究基础。