扶正消岩汤对乳腺癌肿瘤微环境调控机制的研究

冯月男，孙思邈，孔祥定,2，肖洪彬，王宽宇,2*

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

乳腺癌是目前世界上最常见的女性恶性肿瘤，其发病率为女性肿瘤的第一名并呈现出年轻化的趋势，它的发生受遗传、环境等多种因素影响。近年来，乳腺癌的相关研究发现，MicroRNA(miRNA)通过调控机体内的抑癌基因作为“肿瘤抑制因子”发挥作用，也可以通过调控机体内的促癌基因作为“肿瘤激活因子”而发挥作用，调节机体内相关信号通路进而在不同类型乳腺癌的发生发展中起关键作用[1-2]。

巨噬细胞是一类在全身血液系统及组织中广泛存在的免疫细胞，能够分泌多种活性因子来发挥免疫调节及免疫效应作用。同时，巨噬细胞又是肿瘤微环境(TAMs)中重要的且数量最多的炎症细胞，巨噬细胞浸润到肿瘤组织后，不同条件下可分化为抗肿瘤的M1型和促肿瘤M2型[3]。各种研究表明，肿瘤微环境中TAMs主要向M2型巨噬细胞极化，并促使肿瘤向恶性肿瘤进展[4]。因此，逆转TAMs表型由促肿瘤M2表型向抗肿瘤M1表型分化；减弱TAMs对肿瘤的促进作用在乳腺癌中的做进一步探索具有一定价值。扶正消岩汤是黑龙江中医药大学外科主任王宽宇教授的临床经验方，研究表明该方治疗乳腺癌有效，且前期实验证明了扶正消岩汤能提高乳腺癌荷瘤小鼠的免疫功能、调控炎症因子表达，并且能够抑制小鼠体内瘤体增长、有效减缓小鼠体质量下降[5-6]。本研究从扶正消岩汤对肿瘤微环境中M1和M2型巨噬细胞标志因子出发，探讨其对肿瘤微环境的调控作用。

1 实验材料

1.1 细胞

乳腺癌4T1细胞株和人单核细胞系THP-1均购自中国科学院上海细胞库。

1.2 实验动物

SPF级健康SD大鼠24只，雌雄各半，体质量180～220 g，大鼠购于辽宁长生生物技术有限公司，许可证号：SCXK(辽)2020-0001，实验单位使用许可证号：SYXK(黑)2016-004，动物的饲养和使用符合国际动物伦理法。

1.3 药物

扶正消岩汤组成：党参20 g，半枝莲20 g，白术15 g，当归15 g，陈皮15 g，枸杞子15 g，山萸肉15 g，女贞子15 g，半夏10 g，莪术5 g，白芍10 g，茯苓10 g，上述中药饮片购于黑龙江中医药大学附属第一医院，均符合《中华人民共和国药典》(2015年版)要求；环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司，国药准字：H32020857，生产批号：18050825)。

1.4 主要仪器

CO2恒温培养箱(SHEL LAB，型号：SCO6WE)；洁净工作台(苏净安泰，型号：SW-CJ-1FD)；倒置显微镜(OLYMPUS，型号：Ⅸ51)；酶标仪(Diatek，型号：DR-200Bs)；台式离心机(上海安亭科学仪器厂，型号：TGL-16c)；冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器，型号：H-2050R)；制冰机(常熟市雪科电器有限公司，型号：IMS-20)；水浴锅(金坛市江南仪器厂，型号：HH-W-600)。

1.5 试剂及耗材

胎牛血清(Gibco，批号：A3160802)；RPMI-1640培养基(Procell，批号：PM150110)；胰酶-EDTA(吉诺生物医药技术有限公司，批号：GNM25200 )PBS溶液 (ASPEN，批号：AS1044 )；Mouse CD86分子(CD86)试剂盒(上海朗顿生物，批号：BPE20930 )；Mouse CD163分子(CD163)试剂盒(上海朗顿生物，批号：BPE20991)；Mouse白细胞介素 1β(IL-1β)试剂盒(上海朗顿生物，批号：BPE20013)；Mouse 白细胞介素 10(IL-10)试剂盒(上海朗顿生物，批号：BPE20005)；Mouse白细胞介素12(IL-12 p70)试剂盒(上海朗顿生物 ，批号：BPE20750)；Mouse 血管内皮生长因子(VEGF)试剂盒(上海朗顿生物，批号：BPE20450)；Mouse Caspase3试剂盒(上海朗顿生物，批号：BPE20250)；Mouse Caspase9试剂盒(上海朗顿生物，批号：BPE20234)；Mouse Bcl2试剂盒(上海朗顿生物，批号：BPE20227)；Mouse NF-κB试剂盒(上海朗顿生物，批号：BPE20817)。

2 实验方法

2.1 乳腺癌4T1细胞和单核细胞系THP-1细胞培养

细胞置于含1%青链霉素、10%胎牛血清的1640培养基、37 ℃ 5% CO2恒温培养箱中培养，倒置显微镜下观察细胞生长贴壁情况，选取对数生长期的细胞进行后续实验。

2.2 M2巨噬细胞的诱导

THP-1细胞置于含20 ng/mL的IL-4和20 ng/mL的IL-13的培养液中在37 ℃、5% CO2的条件下培养48 h，即为极化型M2巨噬细胞。

2.3 M2型乳腺癌细胞培养

将2.2中获得的M2型THP-1细胞上清液与4T1细胞共培养72 h，用于后续实验。

2.4 含药血清制备

24只大鼠随机分为生理盐水组、扶正消岩汤高、中、低剂量灌胃组，每组6只，生理盐水组按照1 mL/100 g灌胃给药、给药组按照高、中、低分别为20、10、5 g/kg生药按照1 mL/100 g灌胃给药。每日灌胃给药2次，连续7 d，于末次给药1.5 h后，戊巴比妥麻醉，于腹主动脉采血，置于含有枸橼酸钠的离心管中，以3 000 r/min离心15 min，取血浆，于56 ℃水浴条件下灭活30 min，过0.22 μm微孔滤膜除菌后，于-80 ℃下保存，备用。

2.5 扶正消岩汤给药浓度及作用时间的筛选

M2型乳腺癌4T1细胞接种于96孔板中，每孔100 μL，24 h后细胞贴壁，给药组给予带有含药血清的培养液，每组设8个复孔，继续培养24 h和48 h后弃培养液，按试剂盒说明加CCK8试剂，置孵箱内过夜，酶标仪测定490 nm波长处吸光度值，扶正消岩汤高剂量作用细胞48 h抑制细胞增殖效果最佳，故选择此条件用于后续实验。

2.6 细胞转染

将培养的对数生长期M2型乳腺癌4T1细胞依据不同转染操作和不同实验目的分为空白组、NC组(阴性对照组，只加入转染试剂)、扶正消岩汤组及miR-146a mimic、miR-146a mimic+中药组。miR-146a组转染miR-146a mimic模拟物，NC组转染miR-NC，空白组不做干预，转染成功即进行后续实验。

2.7 CCK8法检测miR-146a转染对细胞增殖的影响

测miR-146a对4T1细胞增殖活性的影响。取“2.4”项下转染细胞悬液适量100 μL/孔传至96孔板，24 h后细胞贴壁，换培养液，除空白组及中药组外均加入miR-146a mimic，终浓度20 nmol/L，设8个复孔，继续培养48 h后按照CCK8试剂盒说明书操作，测定490 nm波长吸光度值。

2.8 ELISA法检测扶正消岩汤对转染miR-146a4T1细胞上清液中M1、M2特异蛋白IL10、IL12、CD86、CD163的影响

采用ELISA法进行检测。取“2.4”项下转染细胞悬液适量，按照相应ELISA试剂盒说明书方法操作后，采用酶标仪于490 nm波长下检测各组细胞上清液中细胞因子的含量。以上试验重复3次。

2.9 ELISA法检测扶正消岩汤对转染miR-146a 4T1细胞上清液中TNF-α、IL-1β、NF-κB、RAF-6、IRAK-1的影响

方法同2.8。

2.10 统计学方法

3 实验结果

3.1 扶正消岩汤+miR146a过表达对乳腺癌4T1细胞48 h细胞增殖的影响

由表1可知，与空白组比较，NC组对乳腺癌4T1细胞48h细胞增殖无影响(P>0.05)，扶正消岩汤组、miR-146a mimic组、miR-146α mimic+扶正消岩汤组对乳腺癌4T1细胞48 h细胞增殖有显著抑制作用(P<0.01)。

表1 扶正消岩汤+miR146a过表达对乳腺癌4T1细胞48h细胞增殖的影响

3.2 ELISA法检测细胞中IL10、IL12、CD86、CD163的含量

由表2可知，与空白组比较，NC组对乳腺癌4T1细胞上清液中IL10、IL12、CD86、CD163含量无明显影响(P>0.05)，扶正消岩汤组、miR-146a mimic组、miR-146a mimic+扶正消岩汤组能显著降低IL10、CD163含量(P<0.01)，显著升高IL12、CD86含量(P<0.01)。

表2 扶正消岩汤+miR146a过表达对乳腺癌4T1细胞中IL10、IL12、CD86、CD163含量的影响

3.3 ELISA法测细胞上清液中Caspase3、Caspase9含量

由表3可知，与空白组比较，NC组中乳腺癌4T1细胞上清液中Caspase3、Caspase9含量无明显影响(P>0.05)，miR-146a mimic组、扶正消岩汤组、miR-146a mimic+扶正消岩汤组能显著升高Caspase3、Caspase9含量(P<0.05，P<0.01)。

表3 扶正消岩汤+miR146a过表达对乳腺癌4T1细胞中Caspase3、Caspase9含量的影响

3.4 ELISA法测细胞上清液中TNF-α、IL-1β、NF-κB、RAF-6、IRAK-1含量

由表4、表5可知，与空白组比较，NC组对乳腺癌4T1细胞上清液中TNF-α、IL-1β、NF-κB、RAF-6、IRAK-1含量无明显影响(P>0.05)，扶正消岩汤组、miR-146a mimic组、miR-146a mimic+扶正消岩汤组能显著降低TNF-α、IL-1β、NF-κB、RAF-6、IRAK-1含量(P<0.05，P<0.01)。

表4 扶正消岩汤+miR146a过表达对乳腺癌4T1细胞中TNF-α、IL-1β含量的影响

表5 扶正消岩汤+miR146a过表达对乳腺癌4T1细胞中RAF-6、IRAK-1、NF-κB含量的影响

4 讨论

扶正消岩汤由12味中药组成，其中党参和半枝莲为君药，党参能补中益气、健脾益肺，半枝莲能清热解毒、散瘀消肿，二者配伍起到扶正祛邪的双重功效；臣药白芍配白术能够提升正气、益气健脾，当归活血化瘀、补血行气，增强君药扶正祛邪的功效；再臣以莪术、半夏和陈皮用于消积、行气、止痛，女贞子、山茱萸、 枸杞滋阴补肾，以上6味药共同增强君药扶正的功效；茯苓作为佐药具有利水消肿的作用，同时能够增强白术益气健脾的功效，起到提高免疫功效，诸药共奏扶正消岩之功[6]。

核转录因子(NF-κB)为一个转录因子蛋白家族，它可以调控包括IL-1β、IL-6、IL- 12、TNF-α、黏附分子等在内的许多分子，在各阶段炎症反应及在肿瘤发生发展过程中起着重要的调控作用[7-8]。同时，NF-κB信号通路可以通过蛋白质的生成来调控microRNA(miRNA)的水平，参与机体各种生理、病理过程。miR-146a是一个典型的多功能miRNA[9-11]，miR 146a在炎症因子的刺激下有着高反应性，有研究报道，在TNF-α、IL-1β的刺激下，机体可通过NF-κB通路上调miR-146a的表达，而白介素1受体相关激酶(IRAK-1)和肿瘤坏死因子相关手提因子(RAF-6)是miR-146a的直接靶分子，miR-146a通过与IRAK-1和RAF-6二者的特定区域结合转录后抑制二者的表达，负性调节NF-κB的激活，及下游细胞因子TNF-α和IL-1β等的表达[12]。miR-146a过表达后，IRAK-1和RAF-6的表达水平降低，是的NF-κB通路受到抑制，从而降低机体的炎症反应。本研究显示，用miR-146a-5p模拟物转染后，上调miR-146a-5p的表达，在降低了IRAK-1和RAF-6蛋白表达的同时抑制了NF-κB的激活。与先前[9]的研究一致：miR-146a可通过抑制IRAK1/TRAF6/NF-κB通路来下调乳腺癌中IL-1β和TNF-α的产生。

巨噬细胞M1型和M2间的平衡是维持机体平衡和调控炎症反应所必需的[13]。研究发现，M1型巨噬细胞通过高表达IL-12、CD86、低表达IL-10、参与炎症反应来抑制肿瘤的发展，M2型巨噬细胞通过高表达IL-10、CD163、低表达IL-12，促进免疫耐受[14-16]，促进肿瘤发展。在肿瘤微环境中，TAMs主要向M2型巨噬细胞极化促使肿瘤向恶性肿瘤进展。TAMs在乳腺癌中的作用还需要进一步探索，其可能成为乳腺癌潜在的治疗靶点。本实验通过细胞转染法上调乳腺癌4T1细胞中miR146a的表达，发现miR146a过表达+扶正消岩汤组可显著升高IL12、CD86含量、降低IL10、CD163含量的同时促进促凋亡蛋白Caspase3、Caspase9的表达、下调TNF-α、IL-1β、NF-κB、RAF-6、IRAK-1的表达，说明扶正消岩汤逆转肿瘤由M2期向M1期的转变从而抑制乳腺癌恶化进展的作用机制可能是通过上调miR146a表达从而抑制NF-κB通路中TNF-α、IL-1β、NF-κB、RAF-6、IRAK-1因子的作用，激活促凋亡因子Caspase3、Caspase9的表达来调控乳腺癌的发展。本实验的完成为接下来课题组深入研究扶正消岩汤抗乳腺癌的分子机制提供实验支持。