窖泥源可培养厌氧菌株挥发性代谢产物解析

许育民，冯大鸿，李秋雨，余苗，王洪，沈祥坤，田瑞杰，胡晓龙, 5

1.河南省食品工业科学研究所有限公司， 河南 郑州 450053；

2.郑州轻工业大学 食品与生物工程学院， 河南 郑州 450001；

3.安徽古井贡酒股份有限公司， 安徽 亳州 236814；

4.中国轻工业浓香型白酒固态发酵重点实验室， 四川 宜宾 644000；

5.河南仰韶酒业有限公司 博士后科研工作站， 河南 渑池 472400

0 引言

中国白酒根据生产工艺的差异可分为4种基本香型：浓香型(以泸州老窖为代表)、酱香型(以茅台为代表)、米香型(以桂林三花为代表)和清香型(以汾酒为代表).其中，浓香型白酒，又称泸型白酒，产销量在中国白酒市场中占据极大的份额(约70%)，其浓郁的风味深受国民喜爱[1-2]，其内在风味因子己酸乙酯被确认为是浓香型白酒的主体香气成分[3-4]. 白酒中酯类化合物多呈现果香、奶油香等风味，这从化学本质角度揭示了浓香型白酒深受喜爱的原因，也为浓香型白酒品质划分提供了依据[5].

浓香型白酒中风味物质与窖泥菌群的代谢产物有关，已知的Clostridiumcarboxidivorans、拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)、丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)、科氏梭菌(Clostridiumkluyveri)等[6-9]，其代谢产物己酸、丁酸、乙酸、正丁醇等是浓香型白酒重要的香气物质本体或前体. 梭菌多为专性厌氧微生物，在封窖发酵状态下，能合成多种短链脂肪酸、醇类等风味物质，其中，丁酸梭菌是窖泥中最常见且易被分离得到的梭菌，主要产丁酸和乙酸[10]；科氏梭菌是利用特定培养基从窖泥中分离得到的，主要产己酸，其次产丁酸、乙酸等[9]. 除脂肪酸类化合物外，窖泥菌群所产醇类可直接作为浓香型白酒的香气物质，例如，正己醇可作为浓香型白酒的重要香气化合物贡献花香[11]，异戊醇则具有苹果香气[12]. 此外，在浓香型白酒酿造过程中，Clostridiumghoni、Clostridiumsordellii等菌株能产生异味物质[13]，可能会直接影响浓香型白酒的品质. 已有研究[6,14]中，部分窖泥源可培养厌氧梭菌菌株如Clostridiumcelerecrescens、Clostridiumcarboxidivorans等均被证实具有产己酸、乙酸的能力，而有机酸类经一系列催化、酯化反应后，也可形成己酸乙酯、乙酸乙酯等具有芳香气味的产物. 基于此，本研究拟采用可培养方法，从河南省5家浓香型白酒酒企窖泥中分离厌氧菌株并测定其挥发性代谢产物，以期丰富人们对窖泥源可培养厌氧微生物种属多样性及其挥发性代谢产物的认识，为进一步揭示窖泥源可培养厌氧微生物对白酒风味的具体贡献提供基础数据支撑和参考.

1 材料与方法

1.1 主要试剂

牛肉粉，北京双玄微生物培养基制品厂产；胰蛋白胨、酵母粉、醋酸铵、葡萄糖、NaCl、NaOH，北京奥博星生物科技有限责任公司产；醋酸钠，天津市大茂化学试剂厂产；DL-乳酸钠，上海惠兴生化试剂有限公司产；KH2PO3，广东汕头市西陇化工厂；乙醇，天津市津东天正精细化学试剂厂产；乙醇，色谱纯，天津市富宇化工精细有限公司产；可溶性淀粉，天津市恒兴化学试剂制造有限公司产；琼脂粉、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、十二烷基硫酸钠(SDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)，北京索莱宝科技有限公司产；苯酚、美蓝、氯仿，天津市化学试剂三厂产；半胱氨酸盐酸盐、taq酶PCR扩增试剂盒、引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)、引物1492R(5′-AAGGAGGTGATCCACCC-3′)、1×TAE缓冲液、Maker2000、6×loading buffer、琼脂糖、Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒，生工生物工程(上海)股份有限公司产；除氧袋，日本三菱集团产；CH2Cl2，色谱纯，天津四友有限公司产；叔戊醇、2-乙基丁酸、乙酸正戊酯，色谱纯，中国食品发酵工业研究院产. 以上化学试剂除特别说明外，均为分析纯.

1.2 主要仪器与设备

MP200A型精密电子天平，上海良丰仪器仪表有限公司产；SW-CJ-ID型超净工作台，苏州净化设备有限公司产；LX-C50型立式自动电热压力蒸汽灭菌锅，合肥华泰医疗设备有限公司产；立式双层智能精密型摇床，上海福玛实验设备有限公司产；DF-1型集热式恒温磁力搅拌锅，金坛市中大仪器厂产；2.5 L厌氧罐，日本三菱集团产；DH-400型恒温培养箱，上海鸿都电子科技有限公司产；TGL-20M型高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司产；数字可调式移液枪，上海大龙公司产；Mixer 4K微型涡旋混合仪、离心管，上海生工生物工程有限公司产；DYY-16D型稳压电泳仪，北京六一仪器设备有限公司产；TC1000-G型PCR仪，西安天隆科技有限公司产；WD9403-C型紫外凝胶成像仪，美国Bio-Rad公司产；50 μL微量进样器，上海安亭微量进样器厂产；5977B-7890B型气质联用仪、2 mL进样瓶，美国安捷伦公司产.

1.3 实验方法

1.3.1 窖泥样品采集为了筛选更具多样性的厌氧微生物，本研究窖泥样品采集自河南省5家具有代表性的浓香型白酒酒企正常使用的老窖窖池(窖龄≥12 a)，包括豫东HG酒企、豫西YS酒企、豫北BQC酒企、豫南WGC酒企和豫中JH酒企. 每个酒企均采集窖底泥200 g，置于带有标记的无菌袋中，放入盛有冰袋的泡沫箱中运至实验室，保存备用.

1.3.2 厌氧菌株培养基制备所选培养基为改良梭菌增殖培养基(Modified Reinforced Clostridium Medium，MRCM)：酵母粉3 g，牛肉粉10 g，胰蛋白胨10 g，葡萄糖5 g，可溶性淀粉1 g，NaCl 0.5 g，醋酸钠3 g，DL-乳酸钠2 g，半胱氨酸盐酸盐0.5 g，质量分数为0.5%的美蓝0.2 mL，琼脂15 g(固体培养基时添加)，蒸馏水1000 mL，pH值(7.1±0.1)，1×105Pa灭菌20 min. 接种前加入过滤除菌的乙醇20 mL(改良方法).

1.3.3 窖泥源可培养厌氧菌株分离与纯化除培养基调整为MRCM外，其他操作参照文献[15]的方法对窖泥样品中的厌氧菌株进行分离与纯化.

1.3.4 窖泥源可培养厌氧菌株DNA提取、PCR扩增及测序1)DNA提取：参考何培新等[15]的方法，吸取菌株发酵液1 mL置于无菌离心管中，于10 000 r/min条件下离心1 min，弃上清液，用超纯水洗涤细胞沉淀一次，于10 000 r/min条件下离心1 min，得到最终细胞沉淀，并按照Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书进行菌株DNA提取.

2)PCR扩增：采用细菌16S rRNA通用引物27F和1492R扩增16S rRNA序列，PCR扩增体系及扩增条件参照何培新等[15]的方法.

3)测序：采用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增条带，将扩增合格的目的条带直接送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，并将可信序列提交美国国家生物技术信息中心(NCBI)比对，获得初步鉴定结果.

1.3.5 菌株发酵液GC-MS分析吸取菌株发酵液3 mL，加入1.5 g NaCl充分饱和；吸取饱和菌株发酵液2 mL至15 mL离心管中，加入20 μL内标溶液和等体积CH2Cl2后进行萃取，在涡旋混合仪中于2000 r/min条件下充分振荡20 s，静置分层3 min；采用1 mL医用注射器吸取下层萃取液1 mL，过有机相滤膜(0.22 μm)，将滤液置于2 mL上样瓶中，于4 ℃冰箱中保存待测.

GC条件：色谱柱为安捷伦DB-FFAP柱(60 m×250 μm×0.25 μm)；进样口温度为250 ℃；载气为He；流速为1.0 mL/min；色谱柱升温程序为45 ℃保持3 min，以5 ℃/min的速率升温至220 ℃并保持5 min，运行温度250 ℃保持2 min.

MS条件：EI源电子能为70 eV；电子倍增器电压为1617 V；质量扫描范围为50～550 amu；离子源温度为230 ℃；四极杆温度为150 ℃.

内标溶液的配制(体积分数为1%)：分别移取叔戊醇、2-乙基丁酸和乙酸正戊酯各1 mL于100 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度线处.

1.4 数据处理

采用GC-MS数据分析软件，分析所测定的发酵液挥发性成分数据，MS信号积分参数的初始阈值设置为17.5，记录积分峰的Name、Math、R-Math、Prob值和CAS号，保留所有样品中R-Match大于700的出峰物质. 所有物质含量均以其峰面积与2-乙基丁酸峰面积的比值表示.

2 结果与分析

2.1 菌株鉴定结果分析

根据厌氧菌株菌落的形态差异，从各分离平板生长的菌落中共挑取138株菌，并将其16S rRNA基因序列提交NCBI进行在线比对分析. 上述138株菌的最高相似菌隶属于30个种，其中每种最高相似菌及其对应代表性菌株的编号见表1. 由表1可知，最高相似菌分属于梭菌纲和芽孢杆菌纲中的8个属，包括梭菌属(Clostridium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、Paraclostridium、Terrisporobacter、Muricomes、产己酸菌属(Caproiciproducens)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)和葡萄球菌属(Staphylococcus). 从窖泥分离得到的30种细菌中，仅有15种细菌属于梭菌纲，这远低于已报道的高通量测序得到的窖泥中梭菌纲菌属的数量[16]. 目前，从环境中通过纯培养获得的微生物少于1%[17]，同时窖泥理化成分复杂且梭菌纲细菌多为专性厌氧菌，这可能是导致窖泥中可培养梭菌纲细菌种类较少的原因.

表1 代表性菌株的16S rRNA基因序列分析结果Table 1 The 16S rRNA gene sequence analysis results of representative strains

浓香型白酒酿造采用窖泥固态发酵，窖泥中栖息着众多微生物，包括细菌、古生菌、放线菌、霉菌、酵母菌等，其中细菌和古生菌为主要微生物[18]. 参与白酒香味成分形成的原核微生物主要是芽孢杆菌纲、梭菌纲等细菌[19]，其中梭菌纲细菌为是白酒酿造过程中的一类重要核心功能菌[20]. 目前，酪丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌、丁酸梭菌等均为已报道的从窖泥中分离得到的梭菌属，这表明河南地区窖泥菌属同四川、贵州等地区窖泥菌属存在一定的共性. 芽孢杆菌属多为兼性厌氧菌属，如诺瓦氏芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等. 相较于之前的诸多研究[15,21-22]，本研究首次从窖泥分离得到苯溶副梭菌(Paraclostridiumbenzoelyticum)、彼得罗里氏杆菌(Terrisporobacterpetrolearius)、穆里奇球菌(Muricomesintestini)、半乳糖己酸菌(Caproiciproducensgalactitolivorans)和谲诈梭菌(Terrisporobacterglycolicus)，这也进一步丰富了人们对窖泥源可培养梭菌纲细菌物种多样性的认识.

2.2 挥发性代谢产物分析

采用GC-MS方法，对窖泥中筛选到的30种最高相似菌代表性菌株的发酵液进行挥发性代谢产物的萃取和检测，结果见表2. 由表2可知，菌株发酵液共检测到55种挥发性代谢产物，其中酸类14种、醇类18种、酯类11种、其他化合物12种.

表2 菌株发酵液的挥发性代谢产物Table 2 All volatile metabolites in the fermentation broth of the strain

梭菌纲细菌发酵液中挥发性代谢产物的GC-MS分析结果如图1所示. 由图1可知，15种梭菌纲细菌的挥发性代谢产物包括13种酸类、8种酯类、18种醇类和11种其他类，其中多种梭菌具有较好的产酸(如4-甲基戊酸、2-甲基丁酸、3-苯丙酸等)能力. P24(产孢梭菌)、P135(谲诈梭菌)、P138(七叶梭菌)、P1(酪丁酸梭菌)、P130(苯溶副梭菌)和P27(丁酸梭菌)的产酸能力均强于其他菌株，其发酵液中的丁酸、4-甲基戊酸和3-苯丙酸相对含量均比其他菌株高. P1产己酸和2-甲基己酸能力较高，这也与蒲秀鑫等[21]研究结果一致. 己酸作为白酒中最重要的酸类物质之一[23]，在窖泥中各种微生物的催化、酯化作用下，可产生浓香型白酒的主体香己酸乙酯[24]. 此外，多株梭菌能产多种醇类化合物(如1-丁醇、3-苯丙醇等)，且P135、P24和P101(彼得罗里氏杆菌)产总醇含量相对较高，其中1-丁醇具有特殊的香味，其与乙酸经酯化反应生成的乙酸丁酯具有浓郁的果香. 勾文君等[25]从窖泥中分离得到的一株拜氏梭菌具有相对高产1-丁醇的性能，而本研究中的P25(拜氏梭菌)并未高产1-丁醇，这可能是由菌株之间的性能差异造成的. 同属Terrisporobacter菌属的P101和P135均具有较高的产1-丁醇能力. 除1-丁醇外，P24、P27、P101、P130、P135产3-苯丙醇能力相对较高，而3-苯丙醇是一种天然的香精香料，广泛存在于草莓、肉桂油中，其浓度较高时具有清甜花香，稀释后则具有一股令人愉快的瓜果香味[26]. 相比于酸类和醇类化合物，上述15种梭菌纲细菌所产酯类和其他类化合物含量均较低. 例如，P76(穆里奇球菌)仅产生了少量三甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪，而吡嗪类物质具有焙烤香，在酱香型、兼香型和芝麻香型白酒中含量较高[27-28].

图1 梭菌纲细菌发酵液中挥发性代谢产物的GC-MS分析结果Fig.1 GC-MS analysis results of volatile metabolites in the Clostridium fermentation broth

芽孢杆菌纲细菌发酵液中挥发性代谢产物的GC-MS分析结果如图2所示. 由图2可知，15种芽孢杆菌菌株的挥发性代谢产物主要包括13种酸类、13种醇类、8种酯类和5种其他类. P5(地衣芽孢杆菌)、P21(面状类芽孢杆菌)、P28(富马里奥利芽孢杆菌)、P31(人葡萄球菌)和P112(海内氏芽孢杆菌)的产酸能力均强于其他菌株，且P112产酸能力最强，P10(蕈状芽孢杆菌)产丁酸能力最强. 较上述梭菌纲细菌的挥发性代谢产物，丙酸只在芽孢杆菌纲细菌的发酵液中测得，且含量较低. 芽孢杆菌纲细菌也可产多种醇类物质，上述产酸能力最强的P5、P21、P28和P112产醇能力也较强.另外，P11(凝结芽孢杆菌)产1-丙醇能力较强，而P28、P112产3-苯丙醇能力相对较强. 芽孢杆菌的产酯能力较弱，其中十六酸1-(羟甲基)-1，2-乙二醇酯和异别胆酸乙酯在酯类代谢产物中的含量相对较高. 其他类产物主要是乙偶姻、糖苷和本环类，在挥发性代谢产物中的相对含量较低. 15种芽孢杆菌菌株中，P9(贝莱斯芽孢杆菌)产挥发性成分较少且相对含量较低，其次是P23(Baenibacilluspuldeungensis)、P15(枯草芽孢杆菌)、P72(华氏葡萄球菌)和P16(诺瓦氏芽孢杆菌)，推测它们可能对白酒品质提升的贡献较小. 将图1与图2进行对比可知，梭菌纲细菌的挥发性代谢产物种类比芽孢杆菌纲细菌多，且所产醇类和其他类物质较多. 以P5为例，其为兼性厌氧菌株，从酒醅[29]、大曲[30-31]中均能分离得到，国内相关研究多针对其产酶能力，其复杂的产酶体系是产生醇类物质、酯类物质进而形成白酒独特风味的重要基础.

图2 芽孢杆菌纲细菌发酵液中挥发性代谢产物的GC-MS分析结果Fig.2 GC-MS analysis results of volatile metabolites in the Bacillus fermentation broth

2.3 主成分分析

代表性菌株的挥发性代谢产物载荷图和散点图如图3所示,其中C为梭菌代表菌株编号,B为芽孢杆菌代表菌株编号. 由图3a)可知，条件限制性分析显示Axis1具有68.7%的贡献度，Axis2具有11.2%的贡献度，大多数(41种)挥发性代谢产物分布于Axis1中心垂直线右侧. 由图3b)可知，梭菌纲菌株P1、P24、P27、P96、P101、P130、P135、P138及芽孢杆菌纲菌株P5、P21、P28、P31、P112分布于Axis1中心轴右侧，推测这些菌株是上述挥发性代谢产物的主要贡献菌株. P1和P96主要与丁酸(S3)、己酸(S8)、二甲基己酸(S14)、正己醇(C11)、R-2,3-丁二醇(C16)、3-甲基-丁醇(C17)、氨基肉桂酸甲酯(Z9)等有关，而P5、P21、P28、P31、P112主要与其他挥发性代谢产物有关. P24、P27、P135、P138主要与2-甲基丙酸(S4)、2-甲基丁酸(S5)、戊酸(S6)、4-甲基戊酸(S7)、尿酸(S10)等有关；P101、P130主要与1-丙醇(C10)、3-甲基-1- 己醇(C13)有关；P25、P48、P76、P74、P83、P87、P118主要与乙酸(S1)、丙酸(S2)、苯基丙二酸(S13)、乙偶姻(Q3)、三甲基吡嗪(Q8)、2,6-二甲基吡嗪(Q9)等有关.

图3 代表性菌株的挥发性代谢产物载荷图和散点图Fig.3 The load diagram and scatter diagram of representative strains volatile metabolites

3 结论

本文采用可培养技术从河南省5家浓香型白酒企业窖泥中分离出138株厌氧细菌，基于其16S rRNA基因序列分析出最高相似菌共30个种，分属于梭菌纲和芽孢杆菌纲中的8个属，包括梭菌属、芽孢杆菌属、Paraclostridium、Terrisporobacter、Muricomes、产己酸菌属、类芽孢杆菌属和葡萄球菌属. GC-MS分析结果表明，从筛选的梭菌纲细菌和芽孢杆菌纲细菌中共检测到55种挥发性代谢产物，包括14种酸类、18种醇类、11种酯类及12种其他化合物，且15种梭菌纲细菌的挥发性代谢产物种类(50种)比15种芽孢杆菌纲细菌(39种)多，尤其是醇类和其他类化合物种类较多. 主成分分析结果表明，不同厌氧细菌代谢产物存在一定的差异，如P101和P130主要与1-丙醇、3-甲基-1-己醇呈现较高的相关性，而P28和P112产3-苯丙醇能力相对较强. 本研究在一定程度上丰富了我们对窖泥源可培养厌氧微生物群落及其代谢物多样性的认识，初步分析了上述菌株与挥发性代谢产物的关联，为今后通过窖泥产香功能菌的定向强化提升白酒品质提供了理论依据.