一株高产胞外多糖芽胞杆菌的发酵研究

王 勇，杨 玲，温书恒，陈燕琼

（1.广东植物龙生物技术股份有限公司，广东 珠海 519090；2.国家农产品保鲜工程技术研究中心，广东 珠海 519000）

多糖(polysaccharides)是生物合成的产物，由多个(一般超过10 个)单糖分子通过糖苷键连接形成的高分子化合物，通式为(C6H1206)n，在动物、高等植物、细菌和藻类等生物体内广泛存在[1]，是一类具有多种重要生理功能的大分子物质。研究表明多糖除了具有明显的抗氧化活性、抗肿瘤活性[2]、净化水质[3]的能力外，还能增强细菌生物膜对环境的抵抗力，促进小麦生长的功效。

微生物胞外多糖具有生产周期短、产量高、成本相对较低等优势，是研究和应用较多的一类多糖，筛选新的高产胞外多糖菌株和具有良好理化性质的胞外多糖具有很大的意义。实验室从柑橘根部土壤中筛选出一株纺锤型赖氨酸芽胞杆菌LW-3，前期研究发现其具有较好的溶磷解钾效果[4]。本研究检测发现，LW-3 发酵产物多为胞外多糖，产量可达20 g/L。但目前菌株LW-3 的扩繁能力较弱，采用常规细菌培养基，活菌浓度仅在108cfu/mL 水平上。为促进该菌的转化应用，本研究进行了高密度发酵培养基成分及条件的研究，同时在10 L 发酵罐水平上进行了试验。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株。赖氨酸芽胞杆菌LW-3，前期从柑橘根部土壤中分离筛选所得。

1.1.2 培养基。LB 固体和液体培养基[5]，蔗糖15 g/L、酵母浸膏15 g/L、碳酸钙3 g/L、氯化钠2 g/L、结晶硫酸镁2 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、pH 值7.2～7.3。培养温度32℃，转速200 rpm，培养时间24 h。

1.1.3 主要仪器与设备。隔水培养箱（天津市泰斯特），卧式恒温摇床（天津市泰斯特），恒温水浴锅（北京永光明），高速冷冻离心机（湖南湘仪），紫外可见分光光度计（上海元析），pH 计（OHAUS），超净工作台（苏净安泰），蒸汽灭菌锅，10 L 发酵罐。

1.2 材料准备

1.2.1 LW-3 菌株活化。将保存于斜面培养基上的LW-3菌株划线LB 平板活化，32℃培养24 h，备用。

1.2.2 LW-3 种子液制备。将LB 平板上单菌落划线于LB斜面，32℃培养48 h，再用适量LB 洗脱菌苔作种子液。

1.2.3 LW-3 摇瓶发酵培养。500 mL 锥形瓶中装入50 mL发酵培养基，灭菌后接入50 μL 的LW-3 种子液，32℃、200 r/min，培养26 h。

1.3 研究方法

1.3.1 菌株发酵产物的检测鉴定。使用苯酚硫酸法[6]鉴定胞外产物：LW-3 菌株发酵液4000 rpm 离心30 min，取上清；加入2～3 倍体积95%乙醇，4℃静置过夜；4000 rpm 离心30 min，去上清，将沉淀冷冻干燥后，即为粗多糖。粗多糖复溶于水配制成0.1%的溶液。取5 支洁净的试管编号，1-3 号各加入100 μL 配制好的溶液，4 号加入100 μL 1%葡萄糖溶液，5号加入100 μL去离子水作为对照，然后分别加入l mL 5%苯酚，5 mL 浓硫酸，混匀后沸水浴15 min，冷却至室温，观察颜色是否发生变化。

1.3.2 总活菌量和芽胞量测定。采用平板计数法测总活菌量。芽胞量测定：将发酵液在80℃水浴中保持15 min，再用检测活菌方法测定。以活菌总量作为培养基优化评判标准。

1.3.3 发酵培养基优化

碳源筛选优化。在发酵基础培养基中分别等质量添加玉米淀粉、豆粕粉、糖蜜、可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖，发酵结束取样测定发酵液活菌数。每处理重复3 次，确定最佳碳源，考察不同碳源浓度对活菌数的影响。

氮源筛选优化。在发酵基础培养基中分别等质量添加酵母浸膏、牛肉膏、玉米浆粉、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、细菌学蛋白胨、黄豆粉，发酵结束取样测定发酵液活菌数。每处理重复3 次，确定最佳氮源，考察不同氮源浓度对活菌数的影响。

无机盐筛选优化。在上述筛选的碳源和氮源的基础上，分别添加不同质量硫酸亚铁、硫酸镁、氯化钠、碳酸钙、磷酸氢二钾，发酵结束取样测定发酵液活菌数。每处理重复3 次，确定合适的无机盐种类及浓度。

1.3.4 液体发酵条件优化。芽胞杆菌液体发酵涉及的因素较多，发酵条件对活菌数的影响较复杂。Plackett-Burman试验设计是一种以不完全平衡块为原理的实验设计，能够从众多变量中快速、有效筛选出最为重要的一些因素，供进一步深入研究。同时具有数据处理简单、适用于多个因素等优点，可以用来进行发酵各条件的优化筛选。本实验选择初始pH 值(A)、转速(B)、接种量(C)、发酵时间(D)4 个因素，每个因素取2 个水平，以发酵液活菌数为响应值，对菌株LW-3 的发酵进行Plackett-Burman 试验设计，确定影响菌株发酵的显著因素。

种子液制备如1.2.2。

发酵培养基：玉米浆粉15 g/L、豆粕粉20 g/L、NaCl 为3 g/L、MgSO4为3 g/L、CaCO3为2 g/L。培养温度32℃，500 mL 三角瓶装液量为50 mL。

1.3.5 发酵罐(10 L)扩大培养。将平板活化好的菌种单菌落划斜面，培养至形成90%芽胞，然后水洗出，80℃水浴15 min后作为种子。10 L 发酵罐空罐灭菌操作，121℃、25 min；按6 L 装液量调配培养基，并调节pH 至8.0。加入2 mL 消泡剂，灭菌，121℃、30 min。发酵罐灭菌结束，降温至32～34℃，校正溶氧电极。火焰圈法接种种子液，发酵罐通气量为0.12 m3/h，搅拌转速初始为250 rpm，温度设置为32℃自控。发酵前期每小时记录发酵参数，18 h 后2 h 记录1 次。发酵过程中溶氧不低于20%，镜检芽胞形成率大于90%时结束发酵。

2 结果与分析

2.1 发酵产物鉴定

使用苯酚硫酸法处理粗多糖复溶于水的溶液，溶液变成棕色，证明胞外产物是多糖物质。

2.2 不同碳源对菌株LW-3 液体发酵的影响

由图1 可知，不同碳源对菌株LW-3 活菌量均有一定影响，以豆粕粉为碳源的发酵液活菌最大，为26.3×108cfu/mL，豆粕粉为最佳碳源。不同碳源浓度对活菌数的影响见图2，表明豆粕粉最适添加浓度为20 g/L。

图1 不同碳源对菌株LW-3 活菌量的影响

图2 不同豆粕粉浓度对菌株LW-3 活菌量的影响

2.3 不同氮源对菌株LW-3 液体发酵的影响

由图3 可知，以细菌学蛋白胨为氮源的发酵液活菌数最多，为21.5×108cfu/mL，以玉米浆粉为氮源的次之，考虑到成本，玉米浆粉为最佳氮源。不同氮源浓度对活菌数的影响见图4，表明玉米浆粉最适添加浓度为15 g/L。

图3 不同氮源对菌株LW-3 活菌量的影响

图4 不同玉米浆粉浓度对菌株LW-3 活菌量的影响

2.4 不同无机盐对菌株LW-3 液体发酵的影响

由图5 可知，无机盐种类及浓度对菌数影响不显著。

图5 不同无机盐及其不同浓度对菌株LW-3 活菌量的影响

2.5 发酵工艺优化

2.5.1 Plackett-Burman 试验。设计表及结果如表1，从表2 可知，发酵条件中的B转速、D发酵时间是影响菌量的显著因素。以未编码单位表示的回归方程为：Y1=20.457+1.688A+3.593B-1.229C-2.979D。

表1 Plackett-Burman 试验设计因素、水平及结果

表2 方差分析

2.5.2 摇床转速对菌株LW-3 液体发酵的影响。微生物发酵是需能耗氧过程，有必要考察通气量对菌株发酵的影响，在其他条件一致的情况下，采用120、150、180、200、220 r/min 等不同摇床转速进行发酵试验。试验结果见图6，200 r/min 转速的活菌数最高，为发酵培养的最佳转速。

图6 摇床不同转速对菌株LW-3 活菌量的影响

2.5.3 培养时间对菌株LW-3 液体发酵的影响。芽胞的产生于培养时间具有重要相关性。培养时间过短菌体未完全形成芽胞；培养时间过长，菌体可能已经衰亡。取不同培养时间的发酵液计芽胞数，芽胞产量最高的时间为26～30 h。从发酵效率和经济效益来说26 h 更佳，此时芽胞数量为31.7×108cfu/mL。

图7 不同发酵时间对菌株LW-3 活菌量的影响

2.6 发酵罐（10 L）扩大培养

以摇瓶发酵为基础，进行液体发酵罐（10 L）的扩大培养，16 h 后每次隔2 h 取样做镜检。由镜检结果可知，18 h 时开始形成芽胞，24 h 时已有80%芽胞率，26 h 时镜检芽胞形成率大于 90%时，闷罐后结束发酵。发酵罐（10 L）扩大培养与摇瓶发酵时间基本一致。通过计数发现活菌数为36.2×108cfu/mL，芽胞数为32.2×108cfu/mL。

3 结论

作为植物生防细菌和植物根系促生菌，LW-3 在农业领域有很大的应用潜力，但目前该菌的发酵水平仍然比较低，芽胞率低，是该菌工业化生产的主要限制因素。本文以提高生物量和芽胞率为目的，优化了纺锤型赖氨酸芽胞杆菌LW-3 摇瓶发酵配方及工艺，在此基础上进行了10 L 发酵罐水平的验证。研究结果表明，单一因素筛选试验明确玉米浆粉、豆粕粉、NaCl、CaCO3、MgSO4对菌株LW-3 扩繁具有较大影响，并进一步优化出最优添加量。发酵过程中，高密度菌剂浓度除与菌种本身特性和培养基所含碳源、氮源、无机盐种类及配比有关外，还与发酵工艺参数有关，因此以上述物质为基础成分，利用Plackett-Burman 试验优化培养条件。确定显著影响因素为摇床转速和培养时间后，进一步确定了最优转速和发酵时间。最后在10 L 全自动液体发酵罐水平上进行了扩大培养试验，发现菌体发酵与摇瓶条件下一致，活菌数可达36.2×108cfu/mL，芽胞数为32.2×108cfu/mL，芽胞率为89%。