银杏内生菌及其次生代谢产物研究进展

欧阳晓伦，刘嘉乐，巩光禄，申贵男，袁媛，高亚梅，晏磊，王伟东，2

（1.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院/黑龙江省寒区环境微生物与农业废弃物资源化利用重点实验室，大庆 163319；2.粮食副产物加工与利用教育部工程研究中心）

银杏（Ginkgo bilobaL.）是银杏属的一种落叶树，又名公孙树等。银杏叶是地球上最古老的植物之一，可以追溯到2亿多年前。银杏通常视为药用植物，其种子、叶片和果实可用于抗菌、抗氧化、抗心血管疾病等生物活性药物。但银杏生长缓慢，在自然条件下，从种植到结果需要20年以上的时间，这是银杏产品发展的制约因素[1-2]。银杏在生长的过程中几乎不会感染病原菌或者遭遇虫害，与其自身和内生菌产生的抗菌物质有着密不可分的关系。植物内生菌是指其生活史的部分或全部阶段存在于植物的各种器官、组织以及细胞间隙内，同时宿主植物一般不表现出外在感染症状的一类微生物，包括内生真菌、内生细菌和内生放线菌。植物内生菌在寄主植物的生长和系统进化过程中起着重要的作用，在宿主整个生命过程中，植物内生菌既能保护寄主不受病害，也帮助寄主在不利的环境中生存[3]。由于寄主植物与相关内生菌的独特关系，银杏内生菌是多种具有抗癌、抗菌等生物活性的新型次生代谢产物的重要来源。植物内生菌所会产生的一系列化合物可能成为制药、农业和工业的潜在资源。

微生物次生代谢物为药品的合成开发提供了丰富的前体化合物及合成途径。Stierle等[4]于短叶紫杉（Taxus brevifolia）的树皮中分离出的一株内生真菌安德烈亚紫杉霉（Taxomyces andreanae）其培养液中能检测出紫杉醇以及其他紫杉烷类化合物。从此，越来越多植物内生菌从药用植物如喜树、松树和桃儿七中分离出来[5-6]。从银杏的根、茎、叶、种子和树皮中分离到多种植物内生菌，包括毛霉、曲霉、链格孢霉、青霉等，其产生大量的黄酮类、萜类和其他化合物[7-8]。这些具有生物活性的代谢产物对药物前体开发、农业和工业生产具有吸引力。近年来，随着农业和医药领域市场的要求，植物内生菌作为新型药物来源以及生防资源展现出巨大的潜力。

对近些年关于银杏内生菌及其与宿主植物相同、相似的活性代谢物和一些具有特殊骨架的活性代谢物的研究进展加以总结，为研究者进行相关科研试验提供参考。

1 银杏内生菌多样性

银杏中含有丰富的内生菌种群，现已有超过30种不同的内生菌在银杏中被发现，如链格孢属（Alternaria sp.）、曲霉属（Aspergillus sp.）、毛壳菌属（Chaetomium sp.）、炭角菌（Xylaria sp.）、多节孢属（Nodulisporium sp.）、青霉菌属（Penicillium sp.）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas sp.）、镰孢菌属（Fusarium sp.）、麝香霉属（Muscodor sp.）、小帚梗柱孢属（Cylindrocladiella sp.）、小脆柄菇属（Psathyrella sp.）、伯克霍尔德菌属（Burkholderia sp.）等。总的来说，这些菌属中的许多种从其他植物中也有分离[9-10]。银杏内生菌分离鉴定的焦点常在于能产生生物活性物质的菌种上，且已分离鉴定的银杏内生菌以真菌为主。如Ye等[11]从银杏叶中分离了80种内生真菌，对能产生黄柄曲霉素的菌株Chaetomium CDW7进行了详细的研究，结果表明，其产生的黄柄曲霉素有极强的抗氧化能力，同时，分离出的裂褶菌属（Schizophyllumsp.）、毛壳菌属、青霉菌属、拟茎点霉属（Phomopsis.sp.）、毛盘孢属（Colletotrichumsp.）可能有一定的抗氧化能力。Cui等[27]从银杏根皮中分离出27株银杏内生菌，从中获得了一株能产银杏内酯B（Ginkgolide B）的内生真菌，经鉴定为镰刀菌属（Fusariumsp.）。近年来，随着分子鉴定工具的成熟，通过ITS、rDNA的LSU、SSU部分序列和TEF1等技术，银杏中一些独有的新种陆续被发现，特别是相对较难以分离的内生细菌。如Zhang等[15]在银杏枝干中分离出一株新的银杏内生菌Pseudochaetosphaeronema ginkgonissp.；Yan等[16]在银杏种子的银杏内生菌Streptomyces ginkgonis sp.nov.。Xu等[17]在银杏根部分离出一株革兰氏阳性，好氧的，菌落呈黄色且不产生孢子的放线菌，确定其为诺卡氏菌属（Nocardioidessp.）的一个新种，命名为Nocardioides ginkgobilobaesp.。

在银杏个体中，在不同器官和季节中内生菌的组成有着明显的数量和种类差异。内生真菌中的拟茎点霉属和茎点霉属（Phyllostictasp.）是最容易分离的两个属，因此被认为是占优势的内生菌。这两种优势内生真菌的分布具有组织器官特异性，且在不同季节内存在差异。拟茎点霉属占细枝上内生菌的84.8%，而在叶中和叶柄中分别占16.1%和24.3%。茎点霉属则在叶中内生菌的组成中占据72.9%，叶柄中次之，占65.7%，而细枝中未有发现。叶、叶柄和细枝这三个部位内生真菌种群的时间变化表明，茎点霉属于8月开始出现在叶和叶柄中，并在10月到达数量的峰值，而拟茎点霉属在银杏整个生长周期内都能被分离出来。这说明了这两种优势菌不但具有组织器官特异性，而且存在着季节的差异[12-13]。Kumar等[14]的研究表明，树龄和生长环境的差异是影响银杏根部内生菌群落组成的两个重要因素。利用植物内生菌的组成随个体的地理位置、季节和植物组织器官的变化特点，有望提高银杏内生菌分离的种类和数目。

综上所述，研究者对有显著活力的银杏内生菌进行了种属的确定和培养条件的优化以及产物的分析等方面研究，而对于其他暂时没能表现活性和具有潜在价值的内生菌，常是被忽略。同时，银杏内生菌的群落组成受到了地理位置，季节气候和银杏树龄等多种因素的影响，银杏中不同的组织器官上优势菌群和功能菌群也有所差异。因此，在对银杏内生菌进行研究时，综合考虑影响银杏内生菌多样性的因素，不仅能更加有效便捷的筛选出优势菌或功能菌，而且能提高所分离的银杏内生菌多样性。

2 银杏内生菌次生代谢产物

2.1 黄酮类化合物

抗氧化是预防衰老的重要途径，对于一些由于自身自由基引起的老化相关疾病，如果能够消除过多的氧化自由基预防相关疾病，意义是相当重要的。黄酮类化合物多具有较强的抗氧化性，对食品防腐、抗肿瘤和减缓衰老等有着较好的作用。银杏内生菌能产生黄酮类化合物，并在抗氧化的试验中表现出良好的抗氧化活性。YX-28是一株由Liu等[18]从银杏的细枝上分离的内生菌，经鉴定为炭角菌属（Xylariasp.），采用不同溶剂对其发酵液的成分进行提取，结果表明，在1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）和β-胡萝卜素-亚油酸的抗氧化试验中，其甲醇提取液展示出显著的抗氧化活性，进一步研究发现，其甲醇提取液中含有丰富的酚类物质和黄酮类物质，其中总黄酮类物质的含量达到86.76 mg·g-1，是其具有显著抗氧化活性的主要原因。曲霉菌属（Aspergillussp.）中的大多数种常引起植物腐败和枯萎，而Yan等[34]在银杏中分离的YXf3既能产生一系列的萜类物质，还能产生黄酮类物质，其中包括黄酮醇（Chlorflavonin）及其新的衍生物-黄酮醇A（ChlorflavoninA）。同样，Qiu等[20]在银杏的细枝中分离得到内生菌ST22和SX10，通过光学显微镜和扫描电子显微镜的形态学鉴定表均为曲霉属（Aspergillus），通过分子工具进一步研究发现，ST22被鉴定为构巢曲霉（Aspergillus nidulans），SX10则为米曲霉（Aspergillus oryzae）。ST22和SX10非但未在银杏上表现出病害特征，且能够产生具有良好抗氧化活性的黄酮醇，它们的总黄酮产量分别为0.011 62±0.001 4 mg·mL-1和0.012 56±0.003 78 mg·mL-1。抗氧化试验表明，ST22抗氧化能力为34.17%，SX10抗氧化能力为58.71%。ST22和SX10生产的总黄酮量和展现出较好的抗氧化能力，使其有望成为抗氧化活性剂生产的潜在资源。Pan等[19]从银杏种子中分离出内生真菌-白黄小脆柄菇（Psathyrella candolleana），其 能 产 生 槲 皮 素（Quercetin），对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的最低抑菌浓度为0.390 6 mg·mL-1，显示出较好的抑制作用。黄酮醇、黄酮醇A及槲皮素的结构式如图1所示。

图1 银杏内生菌产生的黄酮类化合物Fig.1 Flavonoids produced by ginkgo endophytes

2.2 抗菌脂肽

抗菌脂肽是由枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）以及纳豆菌（Bacillus natto）等为代表的芽孢杆菌产生的一系列脂肽类物质，通常有表面活性素（Surfactin）、伊枯草菌素（Iturin）、芬荠素（Fengycin）和枯草菌素（Subtilin）等，其分子通常以环脂肽的结构存在[32，35]。抗菌肽在环境治理和医药上上有着抗菌谱广、耐药性低、无残余毒害作用等优点。

Yang等[21]从银杏叶中分离到的Fy11和Zy44（Bacillus amyloliquefaciens）两株内生细菌，两株内生细菌的混合使用能有效的抑制辣椒疫病，其中Zy44所产生的粗脂肽起着主要作用。试验中将辣椒疫霉（Phytophthora capsici）接入到3周大的辣椒苗上，于疫霉接种第7天和第15天接入Fy11和Zy44的混合菌剂，防治效果分别达到84.8%和67.2%。毛色二孢属（Lasiodiplodiasp.）是一类引起林木色变的重要病原菌，Yuan等[22]从银杏中分离到一株解淀粉芽孢杆菌CGMCC 5569，其发酵液其对Lasiodiplodia rubropurpurea、L.crassispora和L.theobromae等引起林木变色的病原菌，均有较强的体外生长抑制作用，抑制率分别为70.22%、69.53%和78.76%。进而利用乙酸乙酯对发酵液进行提取，得到了一系列的抗真菌的脂肽，成分分析表明其中包括表面活性素、杆菌霉素（Bacillomycin）和芬荠素（表面活性素、杆菌霉素和芬荠素的结构如图2所示），解淀粉芽孢杆菌CGMCC 5569及其生物活性成分可能为林木变色病原真菌的生物防治提供新的生物资源。

图2 银杏内生菌产生的粗脂肽Fig.2 Crude lipopeptide produced by ginkgo endophyte

2.3 球毛壳菌素（chaetoglobosins）

球毛壳菌素（chaetoglobosins）是一类通常由球毛壳菌（Chaetomium globosum）产生细胞松弛素，能与细胞内的肌动蛋白丝结合，从而达到抑制细胞的运动和生长。球毛壳菌素在癌症治疗和植物病害防治等领域，是天然的、具有潜力的和有效的化合物[23]。从银杏中分离的内生真菌Chaetomium globosumNo.04的发酵液中分离纯化了6种生物碱，并鉴定出其结构为Chaetoglobosin A、C、D、E、G、R，进而在对匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）和葡萄白腐病菌（Coniella diplodiella）两种植物病原菌的抑菌试验中，这6种生物碱活性浓度为20 μg·disc-1时，显著抑制了匍枝根霉和葡萄白腐病菌的生长，说明内生真菌Chaetomium globosumNo.04对匍枝根霉和葡萄白腐病菌的强效抗菌活性[24]。Xue等[25]也从银杏叶中分离出的球毛壳菌的发酵液中分离得到ChaetoglobosinVb，ChaetoglobosinV和ChaetoglobosinG。ChaetoglobosinV和ChaetoglobosinG在对番茄早疫病菌（Alternaria solani）的抑菌试验中表现出有明显的抑菌活性，测定后其最低抑菌浓度为25 mg·mL-1；ChaetoglobosinV和ChaetoglobosinG对蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereusiand）和铜绿色假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）也有一定的抑菌活性。Chaetoglobosin Vb没有表现出任何活性，与Chaetoglobosin V相比，其C-17和C-21有不同构型，但是Chaetoglobosin Vb，Chaetoglobosin V和Chaetoglobosin G三者能在球毛壳菌（Chaetomium globosum）内相互转化。文中提及的球毛壳菌素的结构式如图3所示。

图3 银杏内生菌产生的球毛壳菌素Fig.3 Chaetoglobosins produced by ginkgo endophytes

2.4 其它产物

银杏内酯类是在银杏提取物中重要的功效组分之一，其中的银杏内酯B（Ginkgolide B）是血小板活化因子拮抗剂，可在临床上用于治疗血栓、急性胰腺炎和心血管疾病，还可用于转移性癌症的治疗，对损伤神经元也有保护作用，同时具有抗氧化，延缓衰老的作用。白果内酯（Bilobalide）是一种有神经保护作用的三萜内酯。Qian等[26]从银杏叶中分离到一株产白果内酯的内生真菌GZUYX13，经鉴定为Pestalotiopsis uvicolavia。该菌株在马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）中生长时产生白果内酯，经高效液相色谱测定，其产生白果内酯的量为106 μg·L-1。Cui等[27]在银杏根皮中筛选出内生真菌SY0056，经鉴定其为Fusarium oxysporum，其在液体发酵培养基中连续培养后，通过HPLC/ESI-MS和13C-NMR等技术从其代谢产物中分离出银杏内酯B。综上所述，通过筛选培养产银杏内酯B的内生真菌，可能解除从银杏叶以及银杏树皮中提取银杏内酯B的资源限制。

银杏内生菌中的部分种属能产生丰富的萜类物质，其可能具有多种生物活性。Wu等[28]在银杏的叶、细枝和根部分离出多株内生真菌，其中SYPF 7131鉴定为Penicillium cataractum，其产生的青霉烯内酯A（Penicimenolidyu A）、青霉烯内酯B（Penicimenolidyu B）及Rasfonin对金黄色葡萄球菌的丝状温敏蛋白（FtsZ）的产生有抑制作用，尤其是Rasfonin，最低抑菌浓度为10 μg·mL-1。YXf3是从银杏叶中分离出的内生曲霉菌（Aspergillussp.），Guo和Yan[29-31]等先后报道了从YXf3的培养液中发现了多种萜类物质Aspergiloid。其 中Aspergiloid A、Aspergiloid B、Aspergiloid C、Aspergiloid D和Aspergiloid I具有多种生物活性，包括细胞毒性、抗菌活性，但Aspergiloid E-H虽均未发现出抗菌活性或细胞毒性等生物活性，但其能作为化学转化合成其他Aspergiloid及其衍生物的前体物质。Aspergiloid、银杏内酯和青霉烯内酯A等化合物结构式如图4所示。

图4 银杏内生菌的其他产物Fig.4 Other products of ginkgo endophytes

3 结论

地球是一个巨大生物资源库，其有植物种类约27万种，以每种植物中分离获得约4种特有的植物内生菌计算，可分离获得内生菌的数量将超过100万种[33]。内生菌的研究开辟了微生物应用研究的新领域，目前工作的重点是筛选能产生与寄主相同或相似次生代谢产物的菌株，经育种改造菌株或改进工艺，利用其工业化生产新型的化合物，以应用于、食品、农业等领域[34]。由此可见，利用植物内生菌获得有效活性物质来替代对宿主植物自身的利用，能够打破某些植物资源生长周期长或不可再生等制约条件，有望成为获得有效活性物质的一种新的手段，具有极大的应用价值和开发潜力。

概述了银杏内生菌有潜力被开发为生物农药、医药或医药前体，这些次级代谢物具有广泛的活性，包括抗菌、抗氧化和生物防治等。同时，银杏内生菌产生的生物活性次生代谢产物合成了新药的机会，因为未来的新药物需要新的化学骨架作为合成的基础，甚至是新的化学骨架可作为前体合成新药，新药的创造与合成则可能为人类未来治愈更多疾病提供有效的途径。

4 展望

如今，从银杏叶中分离出的大多数内生菌仍未对其次生代谢产物进行研究。一般而言，银杏内生菌值得结合形态学，化学分类学和基于多位点的分子系统发育分析进行研究。这种结合的方法学可以发现许多具有独特化学结构及生物活性的化合物。

植物内生菌是多种微生物构成的微生物群体，而且大多数植物内生菌仍然未被有效分离，植物内生菌的起源分子机理不清楚，植物内生菌的作用机理不清楚以及植物内生菌作为生防因子无法实际应用，不同生长时期需要怎样的群落以及何时对植物作用都不清楚等。因此，更深入的探究银杏内生菌和银杏之间的关系，了解银杏树内生菌的分布和种群结构模式可有助于有效探索植物内生菌，以从其他植物中分离出具有独特生物效益和经济效益的植物内生菌[12]。总体而言，未来的研究应重视植物内生菌的起源和植物内生菌的作用机理，将传统培养和非传统培养的方式结合起来，动态追踪植物内生菌的定殖与生长，以便研究植物内生菌的起源及其作用机理。随着植物内生菌研究的深入及其在各个领域的应用，必将给人类带来更多的利益，具有广阔的开发应用前景。