黑曲霉降解废弃聚乙烯地膜的研究

2021-12-30高珊张金艳矫月周畅纪德清李文欣

黑龙江八一农垦大学学报 2021年6期

高珊，张金艳，矫月，周畅，纪德清，李文欣

（1.黑龙江八一农垦大学理学院，大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学食品学院）

黑曲霉是半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、丛梗孢科，是丝状真菌的一个常见品种，广泛分布于全国各地的粮食、植物产品和土壤中，可应用于生产有机酸[1]、加工酶制剂[2]和进行污水处理[3]等方面。其中还含有针对植物学原料的几乎全套的分解酶，包括淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、木质素过氧化酶[4]、阿魏酸酯酶[5]和锰过氧化酶[6]等，对植物性原料能够进行全面协同的分解。由于黑曲霉生长旺盛、发酵周期短、不产生毒素，被美国FDA认证为安全菌种（GRAS）[7]。

地膜按照材料特性分为不可降解地膜和可降解地膜。不可降解地膜是在主要原料为聚乙烯中加入各种添加剂混合制成；可降解地膜是在一段时间内，利用微生物的生理活动、物质之间的化学反应以及紫外照射来相互协同、增效，从而实现无污染降解的一类地膜[8]。聚乙烯是乙烯通过聚合制得的一种热塑性树脂，是国内树脂合成中进出口量最多、产出量最大的品种及五大合成树脂之一，其密度约为0.92 g·cm-3左右，具有稳定的化学性质，并且不溶于水，不容易被酶和微生物降解。聚乙烯主要分为高密度聚乙烯（HDPE）、低密度聚乙烯（LDPE）、线性低密度聚乙烯（LLDPE）3类[9]。现阶段农业生产中使用的地膜大多数为不可降解的聚乙烯地膜，广泛用于作物的覆盖，覆盖面积可达千万公顷以上，可用于小麦、棉花、木耳、土豆、西瓜、药物和茶叶等40余种农作物，使农作物产量增加30%~50%，价值增加40%~60%[10]。但聚乙烯地膜耐低温、耐腐蚀、分子结晶度高、难降解，在环境中它会裂为小碎片残留于土壤，引起土壤板结，降低粮食产量[11]。废弃的聚乙烯地膜碎片还容易在空中漂浮，造成环境污染。因此，将农业生产中废弃的地膜及时处理亟待解决。目前废弃的聚乙烯地膜只是由农户交至回收网点再利用[12]，这种处理方式治标不治本，增加农民的负担和农业成本。很多研究人员都致力于寻找降解废弃地膜的方法，近几年，开发了可降解的地膜，但也只是局限于科学研究和局部使用，大范围应用于生产实际的不多。因此，目前主要采用的方法仍是将废弃的普通聚乙烯地膜进行降解，地膜降解后碳链将发生断裂，使碳原子数减少，从而加速土壤微生物对其降解，减轻地膜对土壤和环境的污染。然而，在自然条件下，普通的聚乙烯地膜降解过程非常漫长，甚至需要几百年[13]。而黑曲霉具有生长旺盛、发酵周期短、不产生毒素、无污染等特点，对烟嘧磺隆[14]、赤霉酸[15]、酒石酸[16]、有机磷农药氧乐果[17]、黄曲霉毒素[18]、人参皂苷Rb1[19]等都具有降解能力。虽然国内外只有利用黑曲霉降解小分子化合物的研究，降解高分子树脂类的研究未见报道。但基于黑曲霉在生物工业上具有裂解高分子有机物的作用[20]，研究尝试探索利用黑曲霉降解高分子化合物聚乙烯地膜，来减轻农用废弃地膜对土壤和环境的污染。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设备

蛋白胨、硫酸氢二钾、酵母浸出粉、硫酸镁、葡萄糖均购自天津致远化学试剂有限公司，纯度为分析纯；黑曲霉购自沂水锦润生物科技有限公司；聚乙烯地膜为吉林省蛟河市漂河镇炳龙家庭农场当年使用过的废弃地膜；干燥土取自黑龙江八一农垦大学校内。

MGC-300A光照培养箱购自上海一恒科学仪器有限公司；DSX-24L高压灭菌锅购自上海申安医疗器械厂；DZG-6050SA真空干燥箱购自上海森信试验仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 马丁培养基的改良

将5.0 g蛋白胨、1.0 g磷酸氢二钾、2.0 g酵母浸出粉、0.5 g硫酸镁和1 000 mL水混合，微温溶解，调节溶液pH值约为6.8，煮沸。加入20.0 g葡萄糖溶解后，摇匀、过滤、分装，高压灭菌。

1.2.2 黑曲霉的活化

首先将市售的黑曲霉配成溶液（吸取灭菌后的马丁培养基3~4 mL到培养皿上，再取2~3 g黑曲霉干粉放入其中，摇匀，使菌体溶解呈悬浮状），然后在改良的马丁培养基上加入1~2 mL黑曲霉液，放入光照强度为80%、37℃的培养箱中培养6 d，使黑曲霉活化。

1.2.3 马丁琼脂培养基的制备及灭菌

在改良的马丁培养基中加入15.0 g琼脂，加热溶化后过滤、摇匀，调节pH值为6.4±0.2。然后将活化后的黑曲霉溶液加到培养基中，将培养基分别装入锥形瓶，用报纸和线绳包扎好瓶口后编号，在121℃下灭菌20 min。

1.2.4 接种培养

把灭菌后的锥形瓶内的黑曲霉溶液全部转移到培养皿中，然后用灭菌后的接种环蘸取黑曲霉溶液在培养皿中划线，盖上培养皿盖后放置20~30 min，使溶液渗透到培养基内，放入37℃光照培养箱中保温培养，光照强度为80%，最后制得黑曲霉菌液。

1.2.5 地膜的降解

首先将制得的黑曲霉菌液取出5 mL，装在喷雾瓶中，均匀喷洒到地膜上，然后取2 cm经40目筛过筛后的干燥灭菌土壤将地膜埋上，无需密封。最后在黑曲霉最佳生长条件下，将样品放在温度为37℃[21]、光照强度为80 %的光照培养箱中培养26 d。同时，将没有喷洒黑曲霉菌液的地膜作为对照处理。

1.2.6 相对分子质量的测定方法

采用乌氏粘度计测粘度的方法分别测定黑曲霉液处理前后废弃地膜的相对分子质量[22]。

（1）将干净的粘度计的B管和C管都接上短橡胶管，然后将其垂直放入30℃的水浴锅中，水浸过F球。

（2）准确称量未处理的废弃的地膜0.813 6 g，用80 mL甲苯在70℃的水浴上加热30 min使其溶解，然后将地膜取出烘干，测其溶解地膜的质量。同样方法处理相同质量的经黑曲霉溶液处理后的地膜。

（3）溶液流出时间的测定

吸取甲苯、废弃聚乙烯地膜混合溶液10 mL，由A管注入F球中，恒温15 min，使溶液全部成分混合均匀。将C管完全夹紧使之密封，在B管处用一个洗耳球将全部溶液经F球、毛细管、E球抽至G球2/3处，打开C管夹子，让C管通入大气，将G球内的全部溶液倒流。此时毛细管内的液体下落，当液面流经a刻度时，立即按计时表开始记录时间，当液面降至b刻度时，再按计时表，测得刻度a、b之间的液体流经毛细管所需时间。

（4）溶剂流出时间的测定

用蒸馏水洗涤黏度计，需要反复地清洗黏度计中的毛细管道。用水清洗1~2次，然后从A管中加入大约15 mL的水溶液。使用相同方法来检测溶剂从空气中流出的持续时间t0。

（5）计算地膜的相对分子质量

增比粘度ηsp的计算公式为[23]：ηsp=ηr-1，其中ηr=t/t0，t和t0分别表示溶液流出时间和溶剂流出时间；

特性粘数[η]的计算公式为[23]：[η]=KMα

式中的K、ɑ、β是与聚合物、溶剂及溶液温度等有关的常数，ηr是相对粘度，ηsp是增比粘度，c是溶液的浓度。

由ηsp/c及lnηr/c得到特性粘数值。

（6）计算地膜的降解率

1.2.7 聚乙烯地膜降解效果的评定

（1）观察法。观察地膜用黑曲霉液处理前后外观的变化，初步判断地膜是否被降解。

（2）相对分子质量测定法。用测出的地膜相对分子质量数据来判定被降解的效果。由于聚乙烯地膜是高分子化合物，没有被降解的废弃地膜相对分子质量较大，被降解后地膜分子的链缩短，相对分子质量减小。因此，用此方法可以准确判定地膜被降解的效果。

2 结果与分析

2.1 观察法研究黑曲霉对废弃地膜的降解效果

将在干燥土壤中掩埋26 d后废弃的聚乙烯地膜取出后洗干净，外观如图1所示。其中，1号为没有经过黑曲霉液处理的土壤掩埋后的地膜，2号为经过黑曲霉液处理的土壤掩埋后的地膜。

图1 1为未经黑曲霉溶液处理的废弃地膜；2为经黑曲霉溶液处理的废弃地膜Fig.1 1 Aband waste plastic film treated without aspergillus niger solution；2 Aband waste plastic film treated with aspergillus niger solution

由图1可以看出，同样质量的废弃地膜经黑曲霉液处理后，不仅大小发生很大变化，而且有明显的收缩现象。这是因为地膜被黑曲霉降解后溶解在土壤中，但地膜没有被完全降解，还有部分地膜残留在土壤中，使地膜变小和收缩。因此，初步推断黑曲霉对地膜有一定的降解作用。

2.2 相对分子质量测定法研究黑曲霉对废弃地膜的降解效果

虽然通过上述方法可以很直观地看出黑曲霉对废弃地膜的影响，但不能准确判定地膜已经被降解，而采用测定地膜相对分子质量的方法可以明确判断地膜是否被黑曲霉降解。因为聚乙烯地膜是高分子化合物，被降解前后残余地膜的相对分子质量是不同的。没有被黑曲霉降解的地膜相对分子质量较大，而地膜被降解后发生分子链的断裂，相对分子质量明显减小。试验相对分子质量和降解率见表1和表2。

表1 溶液流出时间的测定Table 1 Determination of solution flow time

表2 未经黑曲霉溶液处理地膜的ηsp/c，lnηr/c与c关系表Table 2 Relationship between ηsp/c，lnηr/c and c of mulch for treatment without Aspergillus niger solution

采用线性回归函数预测ηsp/c和lnηr/c随浓度变化情况，得到ηsp/c和lnηr/c的预测函数分别为：

计算得到ηsp/c和lnηr/c的预测值如表3所示：

表3 未经黑曲霉溶液处理地膜的ηsp/c，lnηr/c与浓度线性回归预测结果Table 3 Prediction results of linear regression between ηsp/c，lnηr/c and concentration of mulch without treatment by Aspergillus niger solution

根据表3数据绘制ηsp/c和lnηr/c的预测值和真实值折线图（见图2和图3）：

图2 未处理地膜的ηsp/c与浓度折线图Fig.2 The fold line plot of ηsp/c versus concentration of untreated mulch

由表1可知t未处理>t处理，根据1.2.6（5）中公式可以推出η未处理>η处理，从而可以得出M未处理>M处理。联合表1和表2可以计算出ηsp/c，lnηr/c与c的值，然后以溶液的浓度c为横坐标，以ηsp/c及lnηr/c为纵坐标做出ηsp/c-c及lnηr/c-c的关系图，如图3。再通过图3回归线方程计算出[η]，最后联合表1，表2和图3代入1.2.6（5）中公式计算出M未处理=4 321。

图3 未处理地膜的lnηr/c与浓度折线图Fig.3 The fold line plot of lnηr/c versus concentration of untreated mulch

同理，由表1和表3可以计算出ηsp/c，lnηr/c与c的值（见表4），进一步得到经黑曲霉溶液处理后ηsp/c和lnηr/c随浓度变化值，利用线性拟合得到ηsp/c和lnηr/c的预测函数分别为：

表4 经黑曲霉溶液处理地膜的ηsp/c，lnηr/c与c关系表Table 4 Relationship between ηsp/c，lnηr/c and c of treated mulch with Aspergillus niger solution

可计算得出ηsp/c和lnηr/c的预测值（见表5），根据表5绘制经黑曲霉溶液处理后用浓度预测ηsp/c和lnηr/c的预测值和真实值比对折线图（见图4和图5）。

图5 已处理地膜的lnηr/c与浓度折线图Fig.5 The fold line plot of lnηr/c versus concentration of treated mulch

表5 经黑曲霉溶液处理地膜的ηsp/c，lnηr/c与浓度线性回归预测结果Table 5 Prediction results of linear regression between ηsp/c，lnηr/and c of treated mulch with Aspergillus niger solution

然后以溶液的浓度c为横坐标，以ηsp/c及lnηr/c为纵坐标做出ηsp/c-c及lnηr/c-c的关系图，通过图4计算出[η]，最后联合表1，表3和图4代入1.2.6（5）中公式计算出M处理=2 952。

图4 已处理地膜的ηsp/c与浓度折线图Fig.4 The fold line plot of ηsp/c versus concentration of treated mulch

根据测定后地膜的相对分子质量计算出地膜的降解率如下：

从降解率可知，黑曲霉可以降解废弃的聚乙烯地膜。

3 讨论

从研究结果可以看出，黑曲霉溶液对废弃的聚乙烯地膜产生了一定的降解作用，降解率可达到31.7%。目前利用黑曲霉液降解农用废弃聚乙烯地膜和采用相对分子量法测定地膜降解率来推断地膜的降解效果等方面的研究还未见报道，而且，试验没有对影响黑曲霉活性的培养条件及对地膜降解的影响因素进行深入地研究，尤其是降解时间非常短（27 d），因此，此降解率是否达到了最好的降解效果还有待于进一步研究。而且，地膜降解后的产物是生成了二氧化碳还是乙烯也有待考证。

为了提高此方法的降解率和降解效果，今后将在以下几个方面进行深入研究：

（1）研究黑曲霉液的最佳培养条件，以及黑曲霉液浓度、降解温度、光照强度和降解时间等对地膜降解效果的影响，寻找最佳降解条件；

（2）将废弃的农用地膜继续进行人工老化，研究黑曲霉液对不同老化程度地膜的降解效果；

（3）探究其他霉菌和黑曲霉一起联合作用对地膜的降解效果；

（4）增加扫描电镜的测定方法，通过观察黑曲霉液对地膜结构变化的影响研究地膜的降解效果。