肉雏鸡盲肠乳酸菌分离鉴定及对AFB1中毒保护效果的研究

吴倩，陈媛媛，张弘弢，高颖，徐闯

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）

黄曲霉毒素（Aflatoxin）是由黄曲霉及寄生曲霉产生的次生代谢产物，现已鉴定出的黄曲霉毒素有20多种[1-2]。黄曲霉毒素又称仓储型毒素，长期储存在高温且潮湿环境下的饲料被黄曲霉菌污染的几率更高，据联合国粮食和农业组织的统计数据显示，全球大约1/4的农作物及农产品会受到霉菌毒素的污染[3-4]。其中黄曲霉毒素B1（AFB1）分布范围最广，毒性最强，尤其对禽类更敏感[5]。

AFB1能够引起畜禽的急性慢性中毒，破坏肝脏、肾脏、脾脏等解毒器官，抑制生长发育，降低免疫力，诱导肝脏和代谢性疾病的发生，甚至导致毒素残留于肉类产品中。长期食用被黄曲霉毒素污染的食物可导致癌症等疾病的发生[6]。幼龄动物比成年动物对AFB1的易感性更强，造成的危害也更严重[7]。肉鸡采食受AFB1污染的饲料会导致生产性能和脂肪消化率降低，肝脏机能受损，血清中谷丙、谷草转氨酶显著升高，降低总蛋白、白蛋白、球蛋白的浓度[8-10]。

AFB1的性质极其稳定，一经污染就很难去除，是十分棘手的食品安全问题[11]。去除AFB1的方法有很多，过去使用的传统物理或化学方法存在着许多缺点，例如影响食品的营养构成、适口性等，因此需要寻找去除效果显著并且安全无毒的方法[12]。乳酸菌在自然界中分布极为广泛，在动物体内，乳酸菌作为肠道内的优势菌群，其调节肠道微生态平衡，提高机体免疫力且无副作用的特点已被越来越多的研究者所关注[13-15]。近些年以来，利用乳酸菌及其代谢产物去除黄曲霉毒素成为较为安全有效的新方法，也是去除毒素的新研究方向之一。

试验通过乳酸菌分离培养技术和一系列鉴定方法，从健康肉雏鸡盲肠分离乳酸菌，为了验证其对AFB1中毒雏鸡的保护效果，选取1日龄肉雏鸡，每天给与0.3 mg·kg-1AFB1饲粮的同时给与1×108CFU·mL-1的乳酸菌，探讨乳酸菌对其生长性能、血液生化指标的影响，为禽类肠道乳酸菌制剂的研究及霉菌中毒保护剂的研发探究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用1日龄健康白羽肉雏鸡，购自哈尔滨益农禽业有限公司。

1.2 实验试剂

AFB1（Sigma公司），MRS固体培养基、MRS肉汤培养基、革兰氏染色试剂盒、细菌微量生化鉴定管（青岛海博生物技术有限公司），16S rDNA乳酸菌通用引物（吉林库美生物科技有限公司），Taq Master－Mix（康为世纪），DNA marker 2000（索莱宝），琼脂糖（上海生工生物工程有限公司），溴化乙锭（上海生工生物工程有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 菌株的分离纯化培养

将雏鸡颈静脉放血处死，解剖后分离肠道，在超净台中用灭菌生理盐水冲洗后取盲肠内容物，置于10 mL灭菌生理盐水中混匀，静置10 min后，取上清液。将上清液做10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7稀释度，分别从各稀释度吸取100 μL菌液均匀涂布于MRS固体培养基中，做好标记后，常氧条件下在37℃恒温培养箱中倒置培养48 h。挑取乳白色、圆形、凸起、表面光滑湿润、边缘整齐且具有芳香气味的单菌落三角划线接种于MRS固体培养基进行细菌纯培养，每一个菌株纯化2次。

1.3.2 纯化菌株的鉴定

（1）革兰氏染色

经革兰氏染色后，菌体呈阳性，短粗杆状，单个散在或形成链状，无运动性，无芽孢和鞭毛的符合乳酸杆菌特征。

（2）生化鉴定

将单菌落分别接种于七叶苷、纤维二糖、麦芽糖、甘露醇、水杨苷、山梨醇、蔗糖、棉子糖、菊糖和乳糖的生化管中，接种完后用封口膜封口，置于36℃水浴锅中培养24 h，观察生化管变化，参考《常见细菌系统鉴定手册》[16]和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》[17]。

（3）16s rDNA序列分析

PCR扩增体系如表1所示，以液体培养后的菌液作为模版，乳酸菌16S rDNA通用引物：上游：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’；下游：5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’。

表1 PCR扩增体系Table 1 PCR amplification system

PCR扩增程序：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸2 min，循环30次；72℃延伸10 min，4℃保温。

取5 μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳并观察结果，将PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测得基因序列在NCBI上进行BLAST初步确定属种，与GenBank数据库中已知序列进行同源性比对，最后利用MEGA 5.0软件构建系统发育进化树。

1.3.3 动物实验

（1）实验分组

选取1日龄健康白羽肉雏鸡42只，随机分为7组，每组6只，即对照组；AFB1组；AFB1+M1组；AFB1+M2组；AFB1+M3组；AFB1+M4组；AFB1+M5组和AFB1+M8组。对照组饲喂基础日粮，AFB1组每天饲喂含0.3 mg·kg-1AFB1饲料的基础饲粮。AFB1+M1组；AFB1+M2组；AFB1+M3组；AFB1+M4组；AFB1+M5组和AFB1+M8组饲喂含0.3 mg·kg-1AFB1饲料基础饲粮的同时在饮水中添加1×108CFU·mL-1的乳酸菌M1、M2、M4、M5和M8。试验期为28 d，在黑龙江八一农垦大学动物饲养房适应性饲养一周后开始实验。

（2）样品采集及处理

试验期间观察雏鸡健康状况；屠宰前一日晚上断料，供足饮水，次日早晨称体重；心脏采血，2 500 r·min-1离心10 min，分离血清，-80℃冰箱保存；屠宰后摘取心脏、肝脏、脾脏并在生理盐水中洗去血液，用滤纸吸干水分后称重。

（3）测定指标及方法

采用全自动生化分析仪（齐齐哈尔中医院）检测血清中总蛋白、白蛋白、球蛋白、谷丙转氨酶和谷草转氨酶含量。

脏器指数计算公式：器官相对重量=器官鲜重/活体重×100

（4）数据处理

用SPSS17.0软件包处理数据，以单因素方差分析各组间的显著性，P<0.05具有统计学意义。试验所得结果以“平均数（标准差”形式表示。

2 结果与分析

2.1 菌落形态观察结果

取培养后的平板观察，有5株疑似为乳酸菌，分别命名为M1、M2、M4、M5、M8，其菌落边缘整齐、表面光滑湿润、圆形有凸起呈乳白色且具有芳香气味（图1）。

图1 菌落形态观察结果Fig.1 Colony morphology observation

2.2 革兰氏染色镜检结果

菌落形态观察疑似为乳酸菌的菌落经革兰氏染色后，在油镜下观察可见革兰氏阳性菌体呈短粗杆状，单个散在或形成链状，无芽孢和鞭毛，结果显示M1、M2、M4、M5、M8符合乳酸杆菌特征（图2）。

图2 革兰氏染色镜检结果Fig.2 Gram staining results

2.3 生化实验结果

生化实验结果如表2所示：M1、M2、M4、M5、M8这5株菌株的生化特性与乳酸菌一致，与《常见细菌系统鉴定手册》[16]和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》[17]对照后初步确定为乳酸菌。

表2 生化结果Table 2 Biochemical result

2.4 PCR鉴定结果

1%琼脂糖凝胶电泳显示（图3），扩增产物在约1 500 bp处看到清晰条带，与预期目的片段大致相符，可鉴定实验分离菌株为满足测序要求。

图3 菌株的16Sr DNA PCR扩增结果Fig.3 16Sr DNA PCR amplification results of strains

2.5 序列及进化树分析

2.5.1 序列分析

将PCR扩增产物测得的序列与GenBank数据库中的序列进行BLAST同源性比对，结果显示，菌株M1、M4、M5、M8与敏捷乳杆菌（Lactobacillus agilisM58803.2）同源性较高，同源性分别为93.7%、87.3%、90.7%、94.8%，菌株M2与肠乳杆（Lactobacillus intestinalisLC096206.1）同源性较高，为92.1%。

2.5.2 构建系统发育进化树

选取乳酸菌属的15个代表菌株的16S rDNA基因序列，利用MEGA5.0软件构建系统发育进化树（图4）。结果显示，菌株M1、M4、M5、M8与敏捷乳杆菌（Lactobacillus agilisM58803.2）亲缘关系较近，且处于同一支，结合以上鉴定结果可确定M1、M4、M5、M8与敏捷乳杆菌属于同一分支；菌株M2与肠乳杆菌（Lactobacillus intestinalisLC096206.1）处于同一分支。

图4 5株分离菌株的16Sr DNA序列系统发育进化树Fig.4 Development evolutionary tree of 16Sr DNA sequence of 5 strains

2.6 乳酸菌对肉雏鸡体重和脏器指数的影响

如表3，AFB1显著降低了雏鸡的体重（P<0.001），饮水中添加乳酸菌M2、M4和M8的雏鸡体重与对照组相差不大（P>0.05），AFB1+M1组和AFB1+M5组雏鸡的体重指数显著低于对照组（P<0.001）。AFB1组雏鸡的心脏、肝脏和脾脏指数显著高于对照组（P<0.01；P<0.01；P<0.001）；饮水中添加乳酸菌M2、M4和M8的雏鸡心脏、肝脏、脾脏指数与对照组相差不大（P>0.05），AFB1+M1组和AFB1+M5组雏鸡心脏指数显著高于对照组（P<0.05；P<0.01），AFB1+M1组和AFB1+M5组雏鸡肝脏指数显著高于对照组（P<0.001；P<0.01），AFB1+乳酸菌M1组和AFB1+M5组雏鸡脾脏指数显著高于对照组（P<0.01；P<0.01），说明乳酸菌M1和M5对雏鸡的AFB1毒性反应不能起到很好的保护作用，而乳酸菌M2、M4和M8则对雏鸡AFB1的毒性反应起到很好的保护作用。

表3 乳酸菌对肉雏鸡体重和脏器指数的影响Table 3 Effect of Lactic Acid Bacteria on body weight and organ index of broilers

2.7 乳酸菌对肉雏鸡血液生化水平的影响

如表4所示，与对照组相比，AFB1组、AFB1+M1组和AFB1+M5组雏鸡的谷草、谷丙转氨酶显著升高（P<0.001），AFB1+M2组、AFB1+M4组和AFB1+M8组雏鸡的谷丙、谷草转氨酶与对照组相差不大（P>0.05）。如表5所示AFB1组雏鸡总蛋白、白蛋白和球蛋白显著低于对照组（P<0.001），AFB1+M2组、AFB1+M4组和AFB1+M8组雏鸡总蛋白、白蛋白和球蛋白与对照组相差不大（P>0.05）。AFB1+M1组和AFB1+M5组雏鸡的总蛋白显著低于对照组（P<0.01；P<0.001），AFB1+M1组和AFB1+M5组雏鸡的白蛋白和球蛋白显著低于对照组（P<0.05；P<0.001）。说明乳酸菌M2、乳酸菌M4和乳酸菌M8可以改善AFB1导致的血清蛋白含量的降低，而乳酸菌M1和乳酸菌M5效果则不明显。

表4 乳酸菌对肉雏鸡血清酶的影响Table 4 Effect of Lactic Acid Bacteria on serum enzymes of broiler chickens/U·mL-1

表5 乳酸菌对肉雏鸡血清蛋白的影响Table 5 Effect of Lactic Acid Bacteria on serum protein of broilers/g·L-1

3 讨论

不同日龄的雏鸡肠道内菌群组成是不一样的，有研究报道，雏鸡从3日龄开始其消化道内乳酸菌逐渐增加，到16日龄时小肠前段的乳酸菌达到数量平衡，25日龄时乳酸菌在盲肠形成菌群优势[18]。试验成功从30日龄肉雏鸡盲肠内分离到乳酸菌，也说明了30日龄雏鸡盲肠内已存在乳酸菌这一优势菌群。此外，张振瑞等[19]对健康家兔肠道益生菌的研究结果表明，盲肠内容物中需氧及厌氧菌数量均高于回肠，表明盲肠可以作为分离乳酸菌的最佳场所。实验使用革兰氏染色、生化实验等常规细菌鉴定方法初步判定分离的5株菌株为乳酸菌，通过PCR鉴定及遗传系统发育进化树分析等一系列分子生物学鉴定方法[8]，确定M1、M4、M5、M8与敏捷乳杆菌（Lactobacillus agilisM58803.2）亲缘关系较近，菌株M2肠乳杆菌（Lactobacillus intestinalisLC096206.1）处于同一分支。

AFB1会影响人和动物的内脏器官，尤其是肝脏，当机体摄入过量的AFB1会引发急性中毒，出现急性肝炎，出血性坏死等病症[20]，长期低剂量摄入AFB1还可能引发肝癌的发生[21]。家禽对于AFB1的敏感性要高于哺乳动物，李瑞娟等人研究了AFB1对雏鸡血液生理指标的影响，用含有不同浓度AFB1的饲料连续饲喂雏鸡后发现，含2.8 mg·kg-1AFB1日粮会导致雏鸡肝脏出现明显损伤，且肝指数也随之升高，血液生理指标则显著降低[22]。试验选用0.3 mg·kg-1AFB1日粮同样对雏鸡脏器指数和血液生化指标造成影响。

AFB1组雏鸡体重显著低于对照组，说明AFB1对雏鸡的生长发育造成了很大的影响；心脏、肝脏和脾脏指数显著高于对照组，说明AFB1导致脏器增生、肥大；血液中谷草、谷丙转氨酶显著高于对照组，说明肝细胞坏死严重，肝功能异常；白蛋白主要由肝脏合成，其显著降低，说明肝脏发生了炎症反应。免疫球蛋白降低说明AFB1对雏鸡的免疫系统造成了很大的影响。有研究表明，一些益生菌具有降低黄曲霉毒素的活性的作用[23]。2×1010CFU·L-1的乳酸菌可以将AFB1的水平降低到0.1%~13%，可能是益生菌菌体的表面成分参与了AFB1的结合[24]。并且加强益生菌干预可减轻AFB1诱导的毒性[25]。所筛选的5株乳酸菌中，乳酸菌M2、M4和M8能够显著减少AFB1导致的体重下降；显著降低心脏、肝脏和脾脏的脏器指数；降低血清中谷草、谷丙转氨酶含量，说明这3株乳酸菌对AFB1导致的雏鸡中毒具有很好的保护作用。而AFB1+M1组和AFB1+M5组对AFB1中毒雏鸡有轻微的保护作用，但作用效果不明显。

4 结论

试验成功从30日龄健康白羽肉雏鸡盲肠内分离出5株乳酸菌，其中菌株M1、M4、M5、M8与敏捷乳杆菌（Lactobacillus agilisM58803.2）处于同一分支；菌株M2与肠乳杆菌（Lactobacillus intestinalisLC096206.1）处于同一分支。乳酸菌可以通过吸附或降解机制去除AFB1，利用乳酸菌作为解毒剂不仅能减轻动物的毒性反应还有利于动物肠道菌群的平衡，促进动物生长发育。在动物试验中菌株M2、M4和M8显著降低了AFB1中毒肉雏鸡心脏、肝脏、脾脏的脏器指数及血清中总蛋白、白蛋白、球蛋白、谷草、谷丙转氨酶的含量，对AFB1中毒肉雏鸡具有很好的保护效果，但具体的保护作用机制却不清楚。因此，在后续的试验中将会对这3株乳酸菌做进一步的研究，明确乳酸菌对AFB1解毒的作用机制。