565株革兰氏阴性菌对不同抗菌药物的敏感性分析

范荒原，詹宛莹，候立恒，柴文戍

(1.锦州医科大学附属第一医院呼吸与危重症医学科；2.锦州医科大学附属第一医院检验科，辽宁 锦州 121000)

感染性疾病在临床实践中具有挑战性和普遍性，是社区和医院中最常见的疾病之一。革兰氏阴性菌仍然为感染性疾病最多见病原体，包括大肠埃希菌、肺炎克雷伯杆菌和非肠杆菌科细菌的铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌等。感染性疾病分为简单和复杂性感染，不幸的是，许多复杂性感染与高复发率相关，对现有口服抗生素耐药性增加，迫使许多临床医生求助于静脉注射药物，如碳青霉烯类抗菌药物[1]。碳青霉烯类抗生素具有抗菌谱广、抗菌活性强、肾毒性低等特点，已经成为临床治疗中、重度细菌感染的主要药物之一[2]。随着临床耐药菌的不断产生，合理经验性应用抗生素是阻断其传播的重要手段。为更好地了解我院常见分离菌对不同药物的抗菌活性，尽可能减少耐药菌产生机会，以期在治疗感染性疾病临床经验性用药当中，提供科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验药品

观察药品：比阿培南(安信)南京先声东元制药有限公司；对照药品：美罗培南(美平)Sumitomo Dainippon Pharma Co.；亚胺培南(泰能)杭州默沙东制药公司；厄他培南(怡万之)Laboratoires Merck Sharp&Dohme -Chibret；头孢他啶(复达欣)GlaxoSmithKline Manufacturing S.p.A；头孢吡肟(恒苏)江苏恒瑞医药公司；头孢哌酮/舒巴坦(凡琳，1∶1)杨子江药业公司；哌拉西林/他唑巴坦(邦达，8∶1)齐鲁天和惠世制药公司；环丙沙星(西普乐)Bayer Schering Pharma AG；左氧氟沙星(左克)杨子江药业公司；阿米卡星(米英杰)浙江莎普爱思药业公司。

1.2 实验菌株来源与鉴定

试验菌株均来自本院2019年9月至2020年9月住院患者的痰液(193例)、尿液(154例)、腹腔积液(94例)、血液(69例)、伤口脓液(44例)及其他(11例)标本分离到的致病菌(相同患者相同部位只收集1次)，所有菌株均经我院检验科微生物室细菌检定仪(西门子Microscan WalkAway-96Plus)鉴定。利用低温冷冻保存法收藏细菌，每次试验前予菌株复活，分离纯化良好后进行试验。

1.3 培养基

药敏试验用MH肉汤培养基(上海广锐生物科技有限公司)；麦康凯琼脂培养基(北京百欧博伟生物科技有限公司)；血琼脂平板培养基(上海哈灵生物科技有限公司)。

1.4 试验方法

参照Sarker等的试验方法[3]，挑取经18～24 h培养，生长完好的单个菌落进行菌悬液配制，通过浊度仪调制成0.5个麦氏浊度(约1.5×108CFU/mL),再倍比稀释终浓度为6.1×105CFU/L备用。所有试验药品按药品说明书用生理盐水配置成终质量浓度7680 mg/L备用。在96孔无菌培养板第1横的第1列加入290 μL MH肉汤培养基，其他至第2横的第10列中加入150 μL MH肉汤培养基，第1横的第1列再加入10 μL配置好的药品，由左至右逐一进行倍比稀释，最终达到256～0.016 mg/L的试验药品梯度，再最后每孔加入5 μL菌悬液。其中第2横的5～7列为只含菌液、培养基，无药物的阳性对照孔，8～10列为只含培养基，无菌液无药物的阴性对照孔。适当混匀，35 ℃孵育18 h后应用酶标仪读取各孔的吸光度值(A)，与阴性对照孔进行比较，相同者即为该药物对该株菌的最低抑菌浓度(MIC)，若药物浓度为256 mg/L与阳性对照孔的A值完全相同时，视为MIC大于256 mg/L。

1.5 试验结果判断

按CLSI M100-S30(2020)[4]进行抗菌药物临界浓度标准的判读，计算出细菌的敏感率和耐药率，按照Livermore DM等[5]报道，比阿培南对肠杆菌科细菌的折点选取与亚胺培南、美罗培南一致，即≤1 mg/L为敏感，≥ 4 mg/L为耐药，对铜绿假单胞菌和和鲍曼不动杆菌，也参考了亚胺培南和美罗培南对相应菌属/种的折点,对亚胺培南、美罗培南其中一种耐药的菌株，视为碳青霉烯类药物耐药菌株[6]。

1.6 统计学方法

采用SPSS 26.0软件计算MIC50、MIC90及MICrange，比阿培南与其他对照药物敏感率比较采用χ2检验分析，P<0.05表示差异有统计学意义。质控菌株校正药敏试验准确性。

2 结 果

2.1 实验菌株和质控菌株

实验菌株：通过细菌鉴定仪鉴定本次试验产超广谱β内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase，ESBL)大肠埃希菌123株，占大肠埃希菌56.9%(123/216)，大肠埃希菌总检出率38.2%(216/565)为本次试验最多见菌株，与2019年CHINET三级医院细菌耐药监测中大肠埃希菌占革兰氏阴性杆菌构成比最大相同，但检出率略低于报道[7]，本研究样本量受限有关；碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯杆菌(carbapenem-resistant klebsiella pneumoniae，CRKP)占肺炎克雷伯杆菌19.3%(22/114)，占总菌株的3.9%(22/565)；非发酵革兰氏阴性杆菌铜绿假单胞菌的检出率14.1%(80/565)，鲍曼不动杆菌9.6%(54/565)，其中碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌(carbapenem-resistant pseudomonas aeruginosa，CRPA)占铜绿假单胞菌的28.8%(23/80)，占总菌株数的4.0%(23/565)，碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌(carbapenem-resistant acinetobacter baumannii，CRAB)占鲍曼不动杆菌的68.5%(37/54)，占总菌株数的6.5%(37/565)；阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、奇异变形杆菌各占总菌株数的7.0%(40/565)、4.8%(27/565)、6.0%(34/565)。质控菌株：大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853本院检验科微生物室提供。

2.2 抗菌药物对临床常见分离革兰氏阴性菌最低抑菌浓度测定及敏感性结果

比阿培南对产和不产ESBL大肠埃希菌、非碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌、非碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌及非碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌均表现出了良好的抗菌活性，与刘文静等[8]、董婧等[9]报道相似，且MICrange最小(0.016～16 mg/L)，MIC50最小(0.016 mg/L)，MIC90与美罗培南相当(0.06 mg/L)。关于不产ESBL大肠埃希菌，与中国细菌耐药监测报告[10]相比，美罗培南MIC50和MIC90是报告的2倍，亚胺培南MIC50与报告相同(0.12 mg/L)，MIC90是报告的4倍，分析原因，本试验未再划分大肠埃希菌是否碳青霉烯类耐药。对于产ESBL大肠埃希菌碳青霉烯类抗菌药物抗菌活性显著高于其他对照药物(P<0.05)(阿米卡星除外)，但其之间对比无差异性，其中比阿培南和美罗培南的MICrange和MIC50最小且相似分别为0.016～64 mg/L、0.03～64 mg/L和0.03 mg/L、0.03 mg/L，比阿培南的耐药率仅次于美罗培南和亚胺培南。本实验中美罗培南、亚胺培南及阿米卡星对非碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的MIC50，是国外文献报道[11]的1/2。对于CRKP，比阿培南敏感率显著高于美罗培南、亚胺培南、厄他培南、头孢他啶、头孢吡肟、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦(P<0.05)，与国内文献报道[12]相仿，耐药率与环丙沙星相同，低于美罗培南、亚胺培南、厄他培南。本次试验对非碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌的抗菌活性比较中，比阿培南的敏感性最佳，其次阿米卡星、美罗培南，而CRPA中，比阿培南的敏感性显著小于头孢他啶、头孢吡肟、环丙沙星、阿米卡星(P<0.05)，但敏感率高于美罗培南、亚胺培南，其耐药率低于美罗培南、亚胺培南。对于非碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌比阿培南与亚胺培南敏感性最佳，其次美罗培南、阿米卡星，但比阿培南和美罗培南的MIC50(0.125 mg/L)最低，是亚胺培南(0.5 mg/L)的1/4、阿米卡星(1 mg/L)的1/8，比阿培南和亚胺培南的MIC90(8 mg/L)最低，是美罗培南(16 mg/L)和阿米卡星(16 mg/L)的1/2。值得一提的是在对CRAB的敏感性比较中，比阿培南和阿米卡星的敏感率最高，显著高于美罗培南、亚胺培南、头孢他啶、头孢吡肟、头孢哌酮舒巴坦、哌拉西林他唑巴坦、环丙沙星及左氧氟沙星(P<0.05)，且比阿培南的耐药率最低，均低于其他对照药品(P<0.05)。部分肠杆菌科细菌(阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、奇异变形杆菌)比阿培南总的敏感率与美罗培南、亚胺培南及阿米卡星相近(P>0.05)，但显著高于厄他培南、头孢他啶、头孢吡肟、头孢哌酮舒巴坦、哌拉西林他唑巴坦、环丙沙星、左氧氟沙星，差异均有统计学意义(P<0.05)，与戴玮等[13]报道相仿，见表1～11。

表1 不同抗菌药物对不产ESBL大肠埃希菌抗菌活性

表2 不同抗菌药物对产ESBL大肠埃希菌抗菌活性

表3 不同抗菌药物对非CR肺炎克雷伯菌抗菌活性

表4 不同抗菌药物对CRKP抗菌活性

表5 不同抗菌药物对非CR铜绿假单胞菌抗菌活性

表6 不同抗菌药物对CRPA抗菌活性

表7 不同抗菌药物对非CR鲍曼不动杆菌抗菌活性

表8 不同抗菌药物对CRAB抗菌活性

表9 不同抗菌药物对阴沟肠杆菌抗菌活性

表10 不同抗菌药物对产气肠杆菌抗菌活性

表11 不同药物对奇异变形杆菌抗菌活性

3 讨 论

关于碳青霉烯类、头孢菌素类、复合酶抑制剂类、喹诺酮类及氨基糖苷类等11种临床常用抗菌药物的抗菌活性比较研究报道较少，据2019年中国细菌耐药监测网[7]233-243了解到，革兰氏阴性杆菌仍是临床罹患感染性疾病的重要致病菌。本研究是一项评价临床经验用药常用抗生素对医院患者常见分离革兰氏阴性杆菌及部分碳青霉烯类耐药菌的体外抗菌试验研究。新型非典型β-内酰胺碳青霉烯类抗菌药物比阿培南，具有对肾脱氢肽酶、持续高产C类头孢菌素酶以及β-内酰胺酶甚至超广谱β-内酰胺酶(EBSLs)较其他碳青霉烯类抗生素稳定性更强的特点，免遭酶类降解使抗生素不易失活[1]439-444。比阿培南可与细菌细胞膜上的青霉素结合蛋白高度结合，从而抑制细菌细胞壁的生物合成，破坏细菌正常结构发挥杀菌作用。相比较其他碳青霉烯类抗生素比阿培南对革兰氏阴性菌，特别是对铜绿假单胞菌的抗菌能力更强，这与本文相符，且肾毒性更小，这得益于比阿培南的2位C上修饰了三唑阳离子，从而增加了细菌细胞膜的穿透性。现如今比阿培南应用广泛，特别是在治疗下呼吸道感染、复杂性尿路感染、复杂性腹腔感染和血液系统疾病所致粒细胞缺乏的中、重度感染病例上，均获得了显著疗效[14-16]。

本试验抗菌活性比较中发现，碳青霉烯类抗菌药物对临床主要分离到的肠杆菌科细菌，具有显著优势。其中比阿培南与美罗培南抗菌活性相当，较亚胺培南、厄他培南优势更加明显，与艾效曼等[12]541-546研究相似。试验药物比阿培南，尤其对大肠埃希菌、非碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯杆菌、非碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌、非碳青霉烯类鲍曼不动杆菌及常见肠杆菌科细菌的敏感率均达到90%以上，耐药率≤5%。对于CRKP、CRPA及CRAB，比阿培南总的抗菌活性显著高于美罗培南、亚胺培南(P<0.05)。参阅文献了解到，CRKP主要耐药机制是产生碳青霉烯酶[17]，后者会水解碳青霉烯类药物，现已发现的碳青霉烯酶主要有KPC型、IMP型、NDM-1型及OXA-48型，其中产KPC型肺炎克雷伯菌是CRKP中最常见类型[18]，而产OXA-48型肺炎克雷伯菌是对青霉素等窄谱β-内酰胺类抗生素产生耐药性的主要机制。本实验研究表明，头孢菌素类、半合成青霉素类抗生素对CRKP表现出极高耐药性，而比阿培南对其耐药性，仅次于最低的阿米卡星。金属β内酰胺酶是目前临床导致铜绿假单胞菌耐碳青霉烯类药物的重要机制[19]，MBL同样是通过水解抗菌药物，产生耐药特性。结果显示，比阿培南对CRPA的抗菌活性不及头孢菌素类和氨基糖苷类抗生素，但在碳青霉烯类药物中敏感性突出。鲍曼不动杆菌耐药性高，临床治疗难度大，目前仍是重症医学科、呼吸与危重症科、血液科等抗感染治疗的难题，CRAB的产生与抗生素暴露及碳青霉烯类药物使用时间呈正相关[20]，本研究中临床分离到的CRAB占耐碳青霉烯类药物菌的45.1%，略低于其他医院[13]321-327。试验药物比阿培南对CRAB的耐药性明显低于美罗培南和亚胺培南，这与美罗培南及亚胺培南临床应用时间较长可能相关，未来还需做深一步的研究证明。试验部分结果与参考文献部分不相一致，其主要原因为本试验菌株均来自同一家医院，且样本量较少。

综上所述，比阿培南具有对肠杆菌科细菌及碳青霉烯类耐药菌抗菌活性强、耐药率低等优势，可成为临床常见感染性疾病经验性用药中，有价值的选择。与此同时，抗生素的合理应用、依药敏结果指导临床用药，仍是遏制碳青霉烯类耐药菌传播的重要手段。