壳聚糖—胶原支架的物理性能及生物安全性研究

徐长溪，杨晓鹏

(1.锦州医科大学口腔医学院；2.锦州医科大学附属第二医院，辽宁 锦州 121000)

牙周病是危害人类口腔健康的两大疾病之一，它能破坏牙周支持组织，牙周附着丧失，导致牙齿松动脱落，目前牙周再生性手术包括引导组织再生术和植骨术[1]。单纯的引导组织再生术利用膜性材料作为屏障，引导具有再生能力的牙周膜细胞优先占据根面，从而形成牙周组织的再生，单纯的植骨术通过采骨或骨的替代品等移植材料来促进新骨形成，大多数骨移植材料只起到支架材料的作用，单纯引导组织再生和单纯植骨在促进骨缺损再生修复，以及促进牙周组织新附着的形成效果不佳[2- 3]。由于组织工程学概念的引入，牙周组织工程成为新的研究方向，组织工程成功的关键之一是支架材料，壳聚糖，胶原等膜生物材料属于生物支架材料[4- 5]。壳聚糖(Chi)是甲壳类动物外骨骼中几丁质的脱乙酰衍生物。可诱导、刺激结缔组织重建，具有抑菌性[6]。胶原膜具有微孔结构，良好的组织相容性和柔韧性、无抗原性、可降解吸收，网状结构可增加附着力，能促进牙周组织的新生，但存在力学性能差，体内降解速度快等缺点[7-8]。

1 材料和方法

1.1 实验材料

壳聚糖：脱乙酰度85%，厦门星隆达试剂公司；Ⅰ型胶原(上海生工生物试剂公司)；其他试剂均为国产分析纯试剂。实验仪器：LGJ-1C冷冻干燥机(上海医用分析仪器厂)，JSM-7300EX型扫描电镜(日本JEOL产)，721分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)，液压力学测试仪(DCS-5000，SHIMADZU Co，Tokyo Japan)，81-2型恒温磁力搅拌器，PM-6型倒置显微镜及附属照相设备，健康的成年大耳兔6只，体重(2.0～2.5)kg，ICR小鼠雌雄各一半，共12 只，由锦州医科大学动物实验中心提供。

1.2 采用冷冻干燥法制备

配制2%的醋酸溶液，称取一定质量的壳聚糖粉末，将其完全溶解于稀醋酸溶液中，静置一段时间脱气泡，在壳聚糖的醋酸溶液中加入胶原，充分地搅拌，壳聚糖与胶原的质量比分别是1∶1，1∶2和1∶3。加入2%的乙酸溶液至所需体积；再加少量的0.25%的戊二醛(GTA)，混合均匀后再将制备的混合物重新脱气泡，然后注入到玻璃培养皿中，在冷藏柜中4 ℃交联12 h后，再置于冷冻柜中-20 ℃，24 h冷冻成型[9]。将支架浸泡在氢氧化钠碱液中，中和残余乙酸数小时，用蒸馏水反复洗涤至中性，之后冷冻干燥，形成壳聚糖-胶原复合支架，支架两侧紫外线照射30 min备用。

1.3物理性能的检测

1.3.1 孔隙率的测定

液体置换法测定支架孔隙率。将不同比例制成的Chi-Col多孔支架切成适当大小，分3组，每组3个样本，分别置入体积为V1的无水乙醇中，待乙醇充分进入多孔支架的孔隙中，至没有气泡逸出。此时，乙醇体积(浸没支架)记录为V2。轻轻将浸满乙醇的支架样品取出，剩余乙醇体积记为V3。计算材料的孔隙率，如下计算：ε=(V1-V3)/(V2-V3)，每组3个样本，结果取其均值。

1.3.2 孔径大小测定

分别将3种比例制成的Chi-Col支架材料表面喷金处理并进行扫描电镜观察。不同比例每组3块样品，每块样品选取3个视野，每视野测量材料5个孔径值。

1.3.3 力学测试

样本制备成 0.5 cm×2.5 cm×0.03 cm 矩形，在液压力学测试仪上测量其弹性模量和最大拉伸强度，拉伸应变速率为 1 mm/ min，直到膜断裂，按每种比例3个样本测量，每种支架测量3次。

1.4 安全性检测

以壳聚糖胶原质量比为1∶2的比例制成的支架作为实验组进行安全性检测。制备浸提液：将1 g Chi-Col支架材料切割成2 mm大小块状，紫外线消毒后置入50 mL生理盐水中，37 ℃下浸提24 h。

1.4.1 急性全身毒性试验

取ICR小鼠12只，雌雄各半，随机平均分为2组，每组雌雄各一半。对实验组小鼠腹腔注射支架材料浸提液1 mL；对照组注射与实验组相同量的生理盐水。分别于注射后12、24、48、72 h观察小鼠一般情况及毒性表现，以及呼吸、步态、活动等不良反应症状及有无死亡。

1.4.2 皮内刺激试验

新西兰白兔3只，脊柱两侧背部剃毛，暴露皮肤酒精消毒，在两侧各选择5个点，2点间隔2 cm。另一侧在每个点注射与实验侧相同量的生理盐水来作为对照侧。在注射后的24、48、72 h分别观察每一个注射部位及周边组织有无充血、抑胀、积液、坏死等刺激反应，并评价结果。

1.4.3 溶血试验

将实验共分为3组：浸提液为实验组、蒸馏水为阳性对照组、生理盐水为阳性对照组。每组3支试管，8毫升/支，37 ℃水浴30 min。采新鲜兔血4 mL，立即加至抗凝管中。加生理盐水5 mL稀释兔血，每根试管加0.2 mL稀释后的兔血，摇匀，在37 ℃水浴箱中继续保温60 min，所有试管均离心2500 r/min离心5 min后取上清，肉眼观察上清液颜色，显微镜观察沉淀物涂片。用紫外分光光度计在545 nm波长测定上清液的吸光度(A)，计算溶血率。溶血率=(实验组A-阴性组A)/(阳性组A-阴性组A)×100%，评判标准:溶血率小于5%时，可判定该材料无溶血作用。超过5%表明材料有溶血作用。

1.4.4 热原试验

选用3只新西兰白兔，先测定其正常体温，于15 min内，向兔耳缘静脉按10 mL/kg剂量缓慢注入支架材料浸提液，液体温度37 ℃，注射后每隔1 h测量体温1次，共3次，3次中最高的体温减去正常体温的差值为该兔的体温升高值。如果每只兔升温小于0.6 ℃，3只实验兔升温总数小于1.4 ℃，即认为支架材料浸提液无热原反应。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 大体观察

3种比例制得的Chi-Col支架，大小1.2 cm×1.2 cm×1.2 cm，为黄色海绵状，有弹性，表面疏松多孔，可随意修剪，用手触摸感觉有弹性，柔软，支架可以弯曲但不会开裂，说明支架具有较好的柔韧性，见图1。

图1 复合材料的大体形态

2.2 复合材料的孔隙率及孔径

不同配比Chi、Col多孔复合膜孔隙率测量结果的统计分析与比较，各组间比较有显著性差异(P<0.05)，见表1。

2.3 不同比例Chi-Col支架材料的电镜观察

制备的Chi-Col支架扫描电镜下计算孔隙率的大小都很接近，但不同比例复合的支架，孔径的大小有所不同，各组之间差别均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 不同比例Chi-Col支架材料孔隙率，孔径检测结果

2.4 复合支架弹性模量和最大拉伸强度

当Chi/ Col为12时，得到最大弹性模量和最大拉伸强度。A组、B组与C组比较有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 不同比例Chi-Col支架材料弹性模量和最大拉伸强度检测结果

2.5 急性全身毒性试验

结果显示，72 h后，实验组和对照组动物状态良好，呼吸平稳，活动、食欲无异常，未见惊厥、瘫痪和死亡现象。实验前后小鼠体重无明显变化，与对照组无显著性差异。

2.6 皮内刺激实验

皮下注射浸提液后，在3 d观察期间内，各实验侧注射点及其周边组织均未见充血、水肿、积液、坏死等刺激反应，皮内刺激实验阴性，与各对照侧无明显差异。

2.7 溶血试验

材料对新鲜兔血的溶血度平均值为3.6%，小于5%，在允许的范围之内，见表3。

表3 溶血试验测定结果(A值)

2.8 热源试验

实验组体温升高分别为0.31 ℃、0.27 ℃、0.20 ℃，均在0.6 ℃以下，3只新西兰兔温度升高总数为0.78 ℃，在1.0 ℃以下，满足热原检测要求，表明该材料无致热作用，见表4。

表4 注射浸提液后兔体温的变化(℃)

3 讨 论

3.1 支架制备

壳聚糖有良好的生物相容性，无免疫原性，体内降解缓慢，被广泛用于成骨细胞、软骨细胞、雪旺氏细胞、表皮细胞、肝细胞等培养的细胞外支架，它在组织工程中具有很大的潜力，壳聚糖作为一种组织工程支架材料所具有的大量优点虽然得到了研究者的肯定，但也有一些研究文献指出细胞亲和力不够理想[10-11]。胶原具有生物相容性好、免疫原性低、体内易降解、降解速度快等优点[12]，价格低廉，易于获得，在组织工程中应用广泛，但其强度并不理想。在本实验中，壳聚糖和胶原蛋白结合形成多孔支架，用以弥补其单一材料用作组织工程材料的不足。在壳聚糖和胶原的复合过程中，壳聚糖带有正电荷，通过静电作用来与胶原蛋白分子结合，而胶原中含有大量的氨基和羧基亲水基团，因而随胶原的引入，增加了壳聚糖的亲水性，从而也提高了溶质的透氧性能。而壳聚糖提高了胶原网络体系机械强度不足的缺点，可提高支架材料的机械强度和增加其降解时间[13-14]。

3.2 支架物理性能

通过扫描电子显微镜发现3组材料均有的孔径，Chi-Col支架材料呈叶片状，支架的孔和孔之间相互连通构成通孔。孔的分布和孔的互连性对于促进细胞增殖和骨骼向内生长起到关键作用[15]。支架的通孔是一种理想的结构，有利于细胞的生长，有利于营养物质和代谢产物的运输和排出。整个支架内分散着大量微孔，部分区域较为集中，形成支架的孔隙区域;还有部分区域形成了无孔的片状区，说明该支架在一些局部孔比较均匀，但整体范围内均匀性要稍差一些。无孔片状区可能是较厚的孔壁，也可能为孔上结膜形成闭孔所导致。用不同比例的壳聚糖和胶原制备的多孔支架的孔隙率如表1所示。在实际制备多孔支架时，应考虑支架材料的降解速率，如果降解速度快，则初始孔隙率不应过高[16]。在研究范围内，胶原比例越高，支架的吸水性能越好，因此支架的含水量也越高，基本上和材料成分比成线性关系，但是，各壳聚糖胶原支架间的含水量的差距并不大，波动在95%左右。这种现象可能是由于高胶原含量支架中壳聚糖与胶原亲水基团相互作用的结果。从以上数据，我们可以证明壳聚糖—胶原复合支架具有非常好的保水性，这样的支架可以防止体液和营养物质的流失，对细胞生长和组织再生是很有利的。

3.3 支架生物安全性

良好的组织相容性是指存在于体内不会发生全身或局部的毒性反应、不会导致溶血、不会引起炎性和排斥反应，有良好的免疫相容性，有利于骨组织迅速长入材料孔内并与材料紧密结合，Chi和Col具有良好的生物降解性与生物相容性[17]。但是，复合过程中加入了戊二醛交联剂，因此有必要对材料的安全性进行测试[18]。评价生物材料相容性的方法较多，ISO公布的医疗器械生物学评价试验指南(ISO-10993)中基本评价的生物学试验包括细胞毒性、刺激性或皮内反应、全身急性毒性、植入性、血液相容性等。目前评价标准已达到细胞和分子水平[19]。Chi-Col支架的细胞相容性较好，本实验选择了几种较为常见的生物学试验方法，结果发现支架材料溶血率为3.6%，低于5%，故无溶血作用，与生物材料溶血试验的要求相符。热原试验显示3只实验兔的体温升高值分别为0.31、0.20、0.20 ℃均低于0.6 ℃，体温升高数值之和低于1.4 ℃，无热原反应，是组织相容性好的生物材料。综上所述，Chi-Col支架材料属于安全的生物材料，具有良好生物相容性，本研究结果为进一步研究Chi-Col支架材料提供了生物学依据。壳聚糖、胶原等天然聚合物因其良好的结构和生化特性近年来在组织工程中被广泛应用[20]，因此，在此基础上进一步研究壳聚糖-胶原支架的生物学特性，如支架的制备方法、材料力学性能的改善等都是值得深入研究的问题。