一种新型植酸酶的性质及其对蛋鸡生产性能的影响

2021-12-29余璐璐王海燕张广民蔡辉益

饲料工业 2021年23期

■李阳余璐璐王海燕严峰张广民蔡辉益

(1.天津博菲德科技有限公司，天津 301906；2.中国农业科学院饲料研究所，北京 100081)

磷对畜禽的健康和生产性能具有非常重要的作用，由于单胃动物的消化道无法分泌植酸酶，因此，饲料中以植酸磷形式存在的无机磷将无法被有效利用，这样既影响畜禽对磷的利用也造成磷资源的浪费[1]。在实际生产中，常规方法是过量添加无机磷来满足畜禽对磷的需求。过量添加的无机磷会随着粪便排出体外，对环境造成了严重的污染。

为了提高饲粮中植酸磷的利用率，植酸酶在饲料生产中已经被广泛应用[2-3]，这是由于植物性饲料中的磷主要是植酸磷，它是由肌醇与磷酸根形成的肌醇1，2，3，4，5，6-磷酸。植酸酶又称为肌醇六磷酸水解酶，是一种催化植酸及其盐类水解为肌醇和磷酸盐的一类酶，植酸酶广泛存在于动植物组织和微生物（细菌、真菌和酵母）。目前分离出的植酸酶主要有两种，3-植酸酶（EC 3.1.3.8）和6-植酸酶（EC 3.1.3.26），前者最先水解的是肌醇3号碳原子位置的磷酸根，后者最先水解的是6号碳原子的磷酸根[4]。对于不同来源的植酸酶的酶学性质及应用效果已有大量研究。3-植酸酶，水解植酸磷的最终产物为肌醇-1-磷酸[5]，该植酸酶具有较好的耐热性（最适温度55 ℃左右）及较宽的适应pH（pH 2.0～6.0），是目前最具应用前景的饲喂植酸酶之一。Simons等[6]的研究结果表明，日粮中该添加植酸酶可以显著提高磷的利用率，最高可以提高60%左右；基于总磷和可利用磷的含量进行评估，1 000 U/kg 植酸酶使豆粕磷的利用率可提高到57%，使玉米-豆粕日粮磷的生物利用率只提高到了43%。

近年来，由于植酸酶的发酵水平日益成熟，植酸酶对饲料中植酸磷的酶解效率出现瓶颈，现有植酸酶研究水平较难满足市场对于耐温耐酸性能、酶解效率和畜禽生产的需求。试验选用了一种新型耐温植酸酶，该酶选自耐高温真菌微生物，经设计、筛选并通过植酸酶基因的整合表达与毕赤酵母液态高效发酵后获得。本研究旨在探讨其耐温性能、耐酸性能、仿生消化酶解效率以及在蛋鸡生产中的应用效果，为植酸酶的应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

新型植酸酶，选自耐高温微生物，通过植酸酶基因的整合表达并由毕赤酵母高效发酵后获得，来源于某试验室。普通植酸酶，来源于国内某饲用酶制剂厂家，本研究中所有酶活测定均参照GB/T 18634—2009。

1.2 新型植酸酶的酶学性质评价

1.2.1 耐酸性评估

精确称取植酸酶样品0.5 g 于容量瓶中，加入缓冲液摇匀；置于摇床振荡30 min；振荡结束后用缓冲液定容，取适量液体，4 000 r/min 离心5 min；然后取上清液，用不同pH的缓冲液进行适当倍数的稀释，以相应pH 的植酸钠溶液为底物进行酶活力测定。以pH 为横坐标，以相应pH 条件下相对酶活力为纵坐标，做出pH-相对酶活力曲线图。测得最高酶活力（即基准酶活力）时的pH即为测定植酸酶的最适pH。

不同pH条件下植酸酶相对酶活力的计算。以测定最高酶活力为基准（100%），计算其他pH条件下的相对酶活力（%）。

相对酶活力（%）=不同pH 条件下的酶活力/最高酶活力×100

1.2.2 最适温度曲线

精确称取植酸酶样品于容量瓶中，加入缓冲液摇匀后于摇床振荡30 min；4 000 r/min离心5 min；上清液稀释至适当倍数，为待测液；取待测液，将酶活测定过程中水浴温度分别设置为指定温度（梯度设置分别为37、50、60、70、80、85、90、95 ℃），其他的操作与国标法相同。取稀释倍数为10 倍的酶液1 mL 到试管中，将试管快速放入精确设定温度的水浴中，精准计时，计时结束迅速取出，冷却；将热处理过的酶液适当稀释并测定酶活力（X1）。以温度为横坐标，以相应温度条件下相对酶活力为纵坐标，做出温度相对酶活力曲线图。测得最高酶活力（X）时的温度即为最适温度。以测定最高酶活力为基准（100%），计算其他温度条件下的相对酶活力（%）。

相对酶活力（%）=X1/X×100

1.2.3 制粒酶活留存率

用豆粕逐级稀释植酸酶样品，充分混合均匀后加入配合饲料，其中配合饲料按照常规配方配制。分别均匀采集制粒前，以及制粒后的样品各5～10份，每份100 g左右，检测制粒前酶活（X3）和制粒后酶活（X4）。

酶活力存留率（%）=X4/X3×100

1.3 植酸磷酶解效率评估

基于仿生消化系统的植酸酶的酶解效率评价，具体操作方法参照专利CN 107831124 A[17]。以玉米-豆粕型日粮（75%玉米+25%豆粕）为底物，试验设置2个处理组。对照组不加植酸酶，试验组添加高校植酸酶，添加量为1 000 U/kg底物。每个处理4个重复，每个重复1根消化管。

试验日粮总磷含量采用国标GB/T 6437—2018法检测。

1.4 动物试验

选择148 日龄（21 周龄）3 000 只健康、采食量正常、体重均匀的海兰褐产蛋期蛋鸡，分为5 个处理组（见表1），每组6个重复，每个重复100只鸡，各组日粮见表1，试验1 组在添加普通植酸酶的基础上同时添加磷酸氢钙，试验2组添加普通植酸酶，试验3、4、5组为试验组，其中3组在基础日粮的基础上添加新型植酸酶同时不添加磷酸氢钙，试验4、5组添加新型植酸酶同时各添加2 kg/t磷酸氢钙和4 kg/t磷酸氢钙，便于评估该新型植酸酶对于替代饲料配方中磷酸氢钙的效果。预试验时间7周，正式试验时间约20周。饲粮参照NRC（1994）鸡的营养需要配制。基础日粮组成及营养水平见表2。试验期间蛋鸡自由采食，充足饮水，按正常免疫程序进行免疫接种。每天记录每个处理组产蛋数、蛋重及破蛋数，计算平均蛋重和产蛋率、破蛋率，每2周计算日采食量和料蛋比。

表1 试验日粮

表2 基础日粮组成和营养水平(风干基础)

1.5 数据处理

试验数据记录并经Excel 软件处理，然后SPSS 17.0统计软件，用one-way ANOVA程序进行单因素方差分析，Duncan’s法进行各组间多重比较；结果以“平均值±标准差”表示，以P<0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 新型植酸酶的酶学性质

2.1.1 耐酸性

以pH为横坐标，以相应pH条件下相对酶活力为纵坐标，做出pH-相对酶活力曲线图。每个酶活力检测值均为3 个平行检测数值的平均值。试验测得新型植酸酶最适pH 为pH 3.0，将新型植酸酶在pH 3.0的酶活作为基准酶活，检测并计算新型植酸酶和普通植酸酶在各个pH 条件下的相对酶活，结果如图1，可以看出新型植酸酶在pH 2～9 范围内相对酶活大于54.3%，pH 3～6范围内相对酶活大于94.6%，耐酸效果优于普通植酸酶。

图1 不同pH相对酶活力曲线

2.1.2 耐温性

以温度为横坐标，以相应温度条件下相对酶活力为纵坐标，做出温度相对酶活力曲线。试验测得该新型植酸酶的最适温度为85 ℃。将该新型植酸酶最适温度时的酶活作为基准酶活，检测并计算该新型植酸酶和普通植酸酶在各个温度条件下的相对酶活，制作温度相对酶活力曲线图（图2），可见，在温度范围60～95 ℃内相对酶活>67.9%，在温度范围80～90 ℃内相对酶活>87.1%，耐温性明显高于普通植酸酶。

图2 温度相对酶活力曲线

同时，该新型植酸酶的水浴耐温性试验结果表明，相对于普通植酸酶，该新型植酸酶水浴耐温性在80 ℃3 min 条件下相对酶活由56.7%显著提高至87.9%（P<0.05），在85 ℃3 min 条件下由12.5%显著显著提高至74.9%（P<0.05）（见图3）。

图3 新型植酸酶水浴耐温评估结果

2.1.3 制粒酶活留存率

该新型植酸酶实际制粒耐温性试验结果表明，饲料调质温度85 ℃，调质时间60 s，酶活存留率为78%。

2.2 新型植酸酶对玉米-豆粕型底物磷消化率的影响

运用单胃动物仿生消化系统得到磷消化率结果见表3。由表3 可见，与不加植酸酶的基础日粮组相比，添加该新型效植酸酶对玉米豆粕型日粮中磷的酶解效率显著（P=0.001）提高，酶解效率由32.9%提高至82.5%，提高了150.76%，效果明显优于普通植酸酶。

表3 新型植酸酶对玉米豆粕型日粮磷消化率的影响

2.3 该新型植酸酶对蛋鸡生产性能的影响

蛋鸡的生产性能结果见表4。表4 可见，与普通植酸酶组（试验2组）相比，在饲粮中添加磷酸氢钙后（试验1组）可显著提高产蛋率、平均蛋重和日均采食量。而与试验1 组相比，添加该新型植酸酶的3 个处理组（试验3组，试验4组，试验5组）的产蛋率分别显著提高了0.14%（P=0.001）、0.47%（P=0.05）、1.04%（P=0.012），试验5组产蛋率最高，为92.27%；与1组相比，试验5 组的平均蛋重显著增加0.59%（P=0.008），平均蛋重较试验1组增加0.37 g/枚；添加该新型植酸酶的试验3 组、4 组和5 组的日均采食量显著（P=0.005、0.01、0.003）高于试验1组；同时，与试验1组相比，添加了该新型植酸酶的3、4 组和5 组均对破蛋率无显著影响。

表4 新型植酸酶对蛋鸡的生产性能影响

3 讨论

3.1 新型植酸酶的酶学性质

不同来源的植酸酶表现出的酶学性质存在较大差异，目前市场上应用的饲用植酸酶大多来源于微生物。对于微生物来源的植酸酶来说，其菌种的差异、发酵工艺及后处理技术均对植酸酶的酶学性质产生较大影响，进而表现出作用效果的差异。植酸酶应用大多以粉末或者微颗粒的形式在饲料加工调质和制粒之前添加，酶在高温蒸汽的制粒过程中，活力容易大量损失。另外，胃肠道内的消化酶以及胃肠道内的pH，也是影响植酸酶作用效果的重要因素。因此，制备出耐温和耐酸性能佳的植酸酶才具有广阔的应用前景。有研究报道，大部分植酸酶的最适温度在50～60 ℃范围内，植酸酶对磷的消化率也只达到约65%[7]。研究最深入的黑曲霉Aspergillus niger NRRL 3135 菌株产生的PhyA 和PhyB 两种植酸酶，PhyA 的2 个最适pH分别为2.5和5.0，PhyB的最适pH为2.5[8]，大肠杆菌植酸酶AppA的最适pH为2.5[9]。本研究中的耐酸耐温试验结果显示，该新型植酸酶最适pH为3.0，pH 3～6范围内相对酶活大于94.6%，最适pH与Wodzinski[8]等研究结果接近，但其在广域pH范围内仍保持较好活性，说明其耐酸性较好；最适温度高达85 ℃，在温度范围80～90 ℃内酶活存留率>87.1%，相比何邵平等[7]的报道，耐温性大幅提高；水浴试验结果也较好，80 ℃3 min，相对酶活为87.9%；85 ℃3 min，酶活存留率为74.9%；进一步的实际制粒试验结果表明，饲料调质温度85 ℃，调质时间60 s 时，相对酶活为78%，虽然已有研究报道[10]的一种植酸酶的制粒存留率为85.92%，好于本研究中的78%，但是其制粒条件为85 ℃30 s，制粒时间较短，可见，该新型植酸酶在耐温性和耐酸性方面较普通植酸酶有显著进步，较好的酶学性质与其菌种来源、发酵工艺及后处理技术密不可分。

3.2 该新型植酸酶对饲料底物磷消化率的影响

日粮结构配比不同，饲料中肌醇-6-磷酸水平也有差异，也就是植酸酶所作用的底物类型和含量均会不同，因此植酸酶的作用效果也会有波动。有报道指出，植酸酶添加量在500 U/kg 饲料以上时，酶添加量与磷消化率提高间为线性关系；大于1 000 U/kg饲料时，可能无继续表现出改善效果，在饲料中添加再多的酶都很难使饲料中的磷消化率超过70%[11]。本研究以玉米豆粕为底物，添加该新型植酸酶1 000 U/kg底物时，磷的消化率由32.9%提高至82.5%，显著（P=0.001）提高了150.76%，高于贺建华等[11]研究结果。本研究中该新型植酸酶分解底物植酸的效率更高，可以释放出更多的无机磷，能够更彻底降低日粮中磷酸氢钙的用量，这可能是该酶选自耐高温微生物并经过分子育种改良后的结果。

3.3 该新型植酸酶对蛋鸡生产性能的影响

植酸酶的来源不同，会引起作用效果的差异。Zimmer-mann等[12]研究在猪日粮中添加不同来源的植酸酶发现，小麦和黑麦源植酸酶的作用效率只有黑曲霉源植酸酶的40%。雷乔波等[13]的研究也表明，在低磷蛋鸡饲粮中添加相同来源的粉状和颗粒状两种剂型的植酸酶对蛋鸡产蛋性能、蛋品质的影响无显著差异，这可能由于饲料未经过高温制粒过程而造成植酸酶的活性损失较大，因此具有良好的酶学性质才可保证在实际应用获得更好的效果。高峰等[14]将蛋鸡饲料中有效磷水平减少为0.23%和0.19%后，再添加植酸酶，得到与对照组（0.4%）并无显著差异的结果。朱金清[15]的研究显示，添加植酸酶对肥育猪生长性能没有不良影响，由于减少50%磷酸氢钙的添加量，对于日增重、采食量和料肉比均无显著影响，与本研究结论相似。本研究中新型植酸酶对蛋鸡生产性能的影响结果表明，添加新型植酸酶显著提高了蛋鸡产蛋率，最高提高了1.04%（P=0.012），达到92.27%；与普通植酸酶相比，饲料中同时添加150 g/t新型植酸酶（10 000 U/g）和4 kg/t磷酸氢钙，后者的平均蛋重显著增加0.37g/枚，日均采食量显著（P=0.005、0.01、0.003）提高，但对破蛋率无显著影响，这与李连彬等[16]的结果相似。与目前常规配方中普通植酸酶在饲料中的应用（试验1组）相比，试验3、4、5组在使用新型植酸酶的基础上分别替代了全部、7 kg/t磷酸氢钙和5 kg/t磷酸氢钙，结果显示添加新型植酸酶各组均达到了较好的作用效果，因此，该新型植酸酶在蛋鸡饲料配方中的应用，可根据实际生产需要替代或部分替代磷酸氢钙用量。