血清、尿液轻链κ、λ和多参数流式细胞术在多发性骨髓瘤诊断中的临床价值

王焱 杨令芝 仰大贵 苏先旭 蒋鑫

多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一种恶性浆细胞病，以M蛋白过度生成以及溶骨改变为特征，MM在血液系统恶性肿瘤中约占10%[1]。由于M蛋白过度生成，50%左右的MM患者在初次确诊时即出现肌酐清除率下降，部分肾损伤严重的MM患者甚至需要进行血液透析[2]。人体中免疫球蛋白轻链合成速度较重链合成速度高，过量轻链则由浆细胞中移出进入血液成为游离轻链，因此正常人体中血液及尿液游离轻链维持在一定水平,MM患者分泌的M蛋白，导致过量轻链κ链或λ由恶性浆细胞中排除至患者血液，因而血清游离轻链水平的对MM的诊断、治疗疗效评估、患者预后具有重要的意义[3]。然而，有研究表明血液及尿液游离轻链水平与肾小管损伤、重吸收能力以及肾功能受损相关，患者肾脏功能的改变可导致其血液、尿液游离轻链水平发生改变[4]，因此对于浆细胞反应性升高合并肾功能不全患者，血液及尿液游离轻链水平检测难以提供较为准确的诊断结果。与MM患者相比，正常浆细胞的免疫表型与单克隆细胞存在明显区别，因而多参数流式细胞术已成为检测包括MM在内的血液系统肿瘤免疫表型的重要检测手段[5]。然而，由于骨髓样本的采集、贮存、处理，以及浆细胞在骨髓分布可能存在局灶性，检测过程中对浆细胞存在可能的选择性丢失[6]，造成多参数流式细胞术亦存在一定的缺陷。鉴于此，本研究旨在探讨血清、尿液轻链κ、λ检测联合多参数流式细胞术对初诊MM合并肾功能不全患者的诊断价值，为临床提供一定的理论依据，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选在2019年1月至2020年12月都江堰市人民医院进行血清、尿液轻链κ、λ及骨髓多参数流式细胞术检测的151例浆细胞增高合并肾功能不全的患者作为研究对象，其中男90例，女61例；年龄33～84岁，平均年龄(62.18±16.55)岁。以病理活检及《中国多发性骨髓瘤诊治指南(2015年修订)》中MM诊断依据为金标准[8]，MM分期参考修订的国际分期体系(international staging system，ISS)[9]。151例患者中，94例诊断为MM，其中男56例，女38例；平均年龄(60.29±15.24)岁；ISS分期Ⅰ期32例，Ⅱ期39例，Ⅲ期23例。非MM组患者中，男34例，女23例；平均年龄(58.81±17.16)岁。2组患者性别比、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：(1)初诊患者；(2)肾功能不全诊断标准参照《KDIGO慢性肾脏病评价及管理临床实践指南》[7]；(3)肾功能检测结果及临床资料完整。排除标准：(1)合并血液系统疾病患者；(2)合并其他恶性肿瘤患者；(3)已在外院接受过治疗的患者。本项研究经我院医学伦理委员会审查，所使用的临床试验样本可知情同意豁免。

1.3 方法 取入组患者清晨空腹中段尿液5 ml，1 500 r离心5 min，取上清部分；取入组患者清晨空腹外周血5 ml，静置20 min，4 000 r离心10 min，分离血清；免疫比浊法测定患者血清、尿液中轻链κ、λ水平，试剂盒购自贝克曼公司，检测仪器为IMMAGE 800特定蛋白分析仪(美国贝克曼公司)；采用Cobas c501全自动生化仪(瑞士罗氏公司)检测患者血清中尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(serum creatinine，SCr)、β2 微球蛋白(β2-microglobulin，β2-MG)水平；行骨髓穿刺，抽取患者2 ml骨髓，置入肝素抗凝管中，常规方法对细胞表面及胞内抗原进行标记，流式细胞管中加入50 μl骨髓血及2 μl荧光标记抗体(CD38、CD138、CD19、CD56)，孵育，加入氯化铵溶血剂，避光混匀，经洗涤，离心，弃除上清，重悬等程序后，CytoFLEX流式细胞仪(美国贝克曼公司)检测，CD45/SSC 设门，检测细胞荧光阳性细胞百分比，超过20%定义为阳性，检测患者浆细胞所占百分比，CD38、CD138、CD19、CD56阳性率。

2 结果

2.1 2组患者血清、尿液检测指标比较 MM组患者血清及尿液中κ、λ水平高于非MM组患者，差异有统计学意义(P<0.05)；2组患者血清中BUN、SCr、β2-MG水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 2组患者血清、尿液检测指标比较

2.2 2组患者多参数流式细胞术检测指标比较 MM组患者浆细胞比例、CD56阳性率高于非MM组患者，MM组患者CD19阳性率低于非MM组患者，差异有统计学意义(P<0.05)；2组患者CD38阳性率、CD138阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.3 单项指标检测对MM的诊断效能分析 绘制单项诊断MM的ROC曲线，单项检测指标中，AUC>0.7且约登指数>0.5的有浆细胞比例、血清κ、血清λ水平。见表3，图1。

2.4 指标联合检测对MM的诊断效能分析 浆细胞比例、血清κ水平、血清λ水平将单项指标中AUC>0.7且约登指数>0.5，经二元Logistic回归分析，3项指标联合诊断的Logistic回归模型为：In[P/(1-P)]=0.190×浆细胞比例+0.014×血清κ+0.013×血清λ

表2 2组患者多参数流式细胞术检测指标比较 %

表3 单项指标的诊断效能分析

图1 单项指标检测诊断MM的ROC曲线

-8.969，对每个指标的P值进行计算取得预测概率，随后绘制ROC曲线，3项指标联合诊断MM的AUC为0.896，高于3项指标中两两联合检测(Z=3.367、4.152、2.761，均P<0.05)。见图2，表4、5。

图2 指标联合检测诊断MM的ROC曲线

表4 单项指标的Logistic回归分析结果

表5 指标联合检测的诊断效能分析

3 讨论

在血液系统恶性肿瘤中，MM发病率约占第二位，我国MM发病以中老年人群为主，近年来其发病率呈上升趋势[10]。MM由于M蛋白引发的管型肾病，轻链淀粉样变性、单克隆免疫球蛋白沉积病导致患者出现肾脏损伤，MM引发的肾损伤可出现血清肌酐上升、蛋白尿、肾小管病变，临床可以慢性肾病、急性肾损伤为表现，MM患者肾损伤的发病率约为50%[11]。骨髓活检是鉴别MM的重要手段，然而由于骨髓瘤细胞的灶状分布、骨髓样本的稀释，致其诊断敏感性降低。在临床实践过程中，由于骨髓穿刺中的部位选择不当、重复抽吸、抽吸后骨髓液的稀释等原因导致穿刺失败，骨髓推片受染色时间、温度及推片力度等因素的影响，导致细胞形态变化不明显[12]，在风湿性疾病，结核分枝杆菌感染，肝脏疾病，病毒感染等患者中，骨髓浆细胞比例亦呈增高趋势[13]，上述种种因素，造成MM的漏诊及误诊，因此单纯依靠骨髓活检手段难以对MM确诊。

既往认为血清游离轻链是轻链分泌型MM的标志物，然而现有研究发现部分MM患者不仅具有产生完整免疫球蛋白的浆细胞，部分异常浆细胞亦可产生游离轻链[14]，此外部分患者复发时，细胞形态发生变化产生游离轻链的浆细胞占据优势，导致血清和尿液游离轻链增高[15]。本项研究发现，在浆细胞增高的肾功能不全患者中，MM组患者与非MM组患者血清中BUN、SCr、β2-MG水平比较并无明显差异，提示对于合并肾功能不全的浆细胞增高患者，单纯通过肾功能指标鉴别诊断MM并无优势。进一步研究发现MM组患者血清及尿液中κ水平、λ水平高于非MM组患者，与既有研究相似[16]。然而，在肾脏发生病变、免疫性疾病导致肾小管功能受损，肾小管重吸收功能降低时，血清及尿液中游离轻链水平也发生异常[17]。本项研究发现，尽管血清及尿液中κ水平、λ水平AUC较高，但是上述指标的敏感性、特异性并不强。进一步对患者骨髓样本采用多参数流式细胞术检测发现，MM组患者浆细胞比例高于非MM组患者，其免疫表型检测的结果CD56、CD19、CD138、CD38阳性率亦与既往研究相似[18]。而在单项指标检测中，浆细胞比例AUC为0.795，特异性为90.9%，但是敏感性较低。尽管多参数流式细胞术在骨髓样本细胞免疫表型，浆细胞比例鉴别中具有灵敏度高，快速的优势，但是在临床实践中，多参数流式细胞术受MM病灶分布、样本采集、处理及存放的影响，该检测方式的结果仍存缺陷。

对浆细胞增高合并肾功能不全的患者，单一实验室指标难以对MM进行鉴别诊断。本项研究联合血清κ水平、λ水平、多参数流式细胞术指标预测其对MM的诊断效能，结果发现浆细胞比例+血清κ水平+血清λ水平联合诊断的效能最高(AUC=0.896，特异性=89.1%，约登指数=0.69)，提示在浆细胞增高合并肾功能不全的患者中，上述指标能够相互补充，尽管血清κ水平、λ水平在发生肾功能不全的患者中特异性及敏感性不强，但是对于轻链分泌型、存在轻链逃逸的MM患者，其具有较强的敏感性及特异性。多参数流式细胞术能够对骨髓细胞中的多种抗原进行分析，对MM患者骨髓瘤细胞的多种特征具有较高的识别作用，同时对抗原表达水平具有定量检测的优势[19]。本研究亦发现将浆细胞比例、血清κ水平、血清λ水平联合，其AUC较三者中任意两两指标联合检测较高，提示浆细胞比例、血清κ水平、血清λ水平可避免多参数流式细胞在骨髓样本采集、储存、处理中多种因素的影响，克服血清κ水平、血清λ水平在肾功能不全患者中特异性及敏感性不强的劣势，可快速、准确的对浆细胞增高合并肾功能不全患者中MM的发生情况进行鉴别诊断。

综上所述，浆细胞比例、血清κ水平、血清λ水平可作为MM的辅助诊断措施，还需扩大样本含量，提高骨髓穿刺及取样的成功率，此外本研究的不足之处是缺乏经治疗后出现轻链逃逸的MM患者，对上述指标在鉴别诊断及预测患者预后的研究仍需深入探讨。