高效液相色谱法测定饲料中胆固醇

侯林丛，刘丽芳，陆 静，刘丹丹，兰尊海＊

（1.河南海瑞正检测技术有限公司，河南 郑州 450001；2.河南工业大学生物工程学院）

胆固醇又称胆甾醇，一种环戊烷多氢菲的衍生物，胆固醇是动物体维持正常生理活动所必需的物质，在动物体内经过代谢还能转化为胆汁酸、7-脱氢胆固醇，且7-脱氢胆固醇经紫外线照射会转变成为维生素D3，适量的胆固醇对维持机体正常生理功能具有重要意义。但堆积过多的胆固醇也会影响动物的健康。从20世纪80年代开始，胆固醇逐渐成为国内外研究的热点［1］。

目前胆固醇的测定方法主要有直接试剂盒法和间接试剂盒法［2］、气相色谱法［3-6］、短波近红外光谱法［7］、气相色谱-质谱法［8-12］、高效液相色谱法［13-20］、比色法［21-23］、液相色谱-质谱法［24-27］等。其中比色法是传统方法，操作复杂，所需试剂较多，结果有偏差故而不能广泛应用，质谱法对仪器和人员的要求较高，在一定程度上增加了检测的成本。该研究通过与气相色谱法进行试验比对后，在大量试验基础上优化饲料中胆固醇的高效液相色谱法测定条件，以期为基层检测机构及饲料生产企业的检验人员提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与主要试剂

e2695高效液相色谱仪，配紫外检测器；BSA224S分析天平；旋转蒸发器。

胆固醇标准品（纯度≥99%）、甲醇（色谱纯）、无水乙醚（分析纯）、抗坏血酸（分析纯）、无水乙醇（分析纯）、氢氧化钾（分析纯）；蒸馏水、高纯水。

饲料原料、配合饲料、浓缩饲料等均为客户委托检测的样品。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理

1.2.1.1 皂化

称取适量样品于250 ml 锥形瓶中，加入1g 抗坏血酸、30 ml 无水乙醇、10 ml 50%氢氧化钾溶液，混匀，沸水浴回流40 min，期间不断摇晃锥形瓶，防止样品粘底。皂化完成，分别用无水乙醇和蒸馏水自冷凝管顶端冲洗其内部，取出锥形瓶，用冷水迅速冲凉，放置避光处。

1.2.1.2 提取

用蒸馏水将皂化液转移至分液漏斗内，分别用40 ml、30 ml、30 ml分3次萃取，弃去水相，合并乙醚层，用蒸馏水洗涤至中性，萃取的过程要防止损失，如产生乳化现象，可加少量的乙醇进行破乳。

智能变电站装配式建筑造价评价问题的条件假设数学描述如下：假设智能变电站装配式建筑工程池中有n个装配式建筑工程造价水平待综合评价，则可供选择的装配式建筑工程集为N={N1,…,Nk,…,Nn}，其中表示n个造价影响因子，影响因子权重向量表示为假设有m位专家参与装配式建筑造价评价，则将专家集表示为S={S1,S2,…,Sm}，专家权重向量表示为

1.2.1.3 浓缩

将洗至中性的乙醚提取液通过无水硫酸钠脱水后放置于旋转蒸发器上50 ℃旋蒸至近干，并回收乙醚，用甲醇转移至容量瓶中定容，并稀释至适当的浓度，0.45 μm滤膜过滤，用于高效液相色谱仪分析。

1.2.2 标准溶液配制

胆固醇标准贮备液（1 mg/ml）：准确称取100 mg 胆固醇标准品用无水乙醇溶解定容，摇匀配制成标准贮备液，4 ℃密封避光保存，有效期6个月。

胆固醇标准使用液：分别移取一定体积的胆固醇标准贮备液于100 ml棕色容量瓶中，用甲醇定容，配制成10 μg/ml、25 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml、500 μg/ml系列标准工作溶液，待测。

2.2.3 色谱条件

C18柱，长250 mm，内径4.5 mm，粒径5 μm；甲醇∶水（96∶4，V∶V）。流速1.0 ml/min。检测波长205 nm；柱温30 ℃；进样量10 μl。

2.2.4 计算公式

c—由标准曲线得出的试样溶液中胆固醇的质量浓度，μg/ml；

V—试样定容体积，ml；

m—试样质量，g。

3 结果与分析

3.1 前处理条件的优化

3.1.1 皂化时间的选择

比较了20 min、40 min、60 min 3种不同时间的皂化效率，皂化效率排序为60 min≥40 min＞20 min，在考虑到效率的问题上，选用了40 min 作为皂化时间，3 组样品不同皂化时间的回收率及相对标准偏差（RSD）结果见表1。

表1 不同皂化时间的结果（n=3）

3.1.2 提取溶剂的选择

该方法选用同一样品，采用相同的皂化时间平行测定3次，比较正己烷、无水乙醚、石油醚等3种提取溶剂的影响，发现提取溶剂对回收率的影响较大。使用正己烷时，回收率较低；无水乙醚和石油醚的回收率基本一致，但使用石油醚作为提取溶剂时，样品分层较慢，且容易乳化，耗时较长。综合考虑，选择无水乙醚作为提取溶剂。不同提取溶剂的回收率及RSD结果见表2。

表2 不同提取时间的结果（n=3）

3.1.3 流动相的选择

该研究使用甲醇∶水（96∶4，V∶V）、甲醇、乙腈∶水（96 ∶4，V ∶V）3 种流动相对标准溶液及样品溶液进行分离测定，通过调节流动相中各组分的比例，使流动相的极性发生变化，改变分离效率。结果表明，不同流动相的色谱峰保留时间及峰型各有不同，当流动相为甲醇∶水时，色谱峰峰型较好，保留时间为21 min左右，胆固醇标准溶液和样品溶液色谱图见图1、图2。

图1 胆固醇标准溶液色谱图

图2 胆固醇样品溶液色谱图

3.2 方法线性和检出限

分别移取标准使用溶液注入高效液相色谱仪中，以其浓度值为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。浓度范围在10.0～500.0 μg/ml时，溶液浓度和色谱峰面积呈现良好的线性关系，Y=3092X+4394.4，r2=0.9995。

取空白样品，按照样品处理程序处理后上机测定。另取多份空白样品，加入不同的较低浓度的胆固醇标准工作液，按照样品处理程序处理后上机测定，对比结果，将引起3 倍信噪比时的浓度定义为方法检出限，当样品称样量为5 g时，该方法检出限为1.0 mg/kg，方法灵敏度较高。

3.3 方法精密度

选取饲料原料（鸡肠粉）、猪配合饲料、猪浓缩饲料等3 种不同的饲料产品进行精密度试验（n=6），测定结果见表3，可以看出，3种不同饲料产品的RSD均不大于5.0%，说明该方法的准确度较高。

表3 精密度测定结果（n=6）

3.4 回收率试验结果

取不同基质的空白样品为本底样品，分别添加2.0 mg/kg、5.0 mg/kg、10.0 mg/kg 3个不同浓度的胆固醇标准溶液，按照该方法进行试验操作，平行测定3 次，回收率在88.6%～93.2%之间，RSD 为0.89%～3.65%，方法回收率较高，详见表4。

表4 回收率测定结果（n=3）

3.5 不同方法结果的比较

利用该研究建立的方法针对同一样品与现有的气相色谱法进行了结果比较，结果见表5。结果表明，两种方法结果差异不显著。

表5 两种方法的检测结果

4 结论与讨论

该研究建立了饲料中胆固醇的高效液相色谱测定方法。通过对皂化时间、提取溶剂进行优化，分别对饲料原料、配合饲料、浓缩饲料等3 种不同的饲料样品进行了精密度、准确度及灵敏度试验，测得6 组数据的相对标准偏差为1.64%～2.09%，不同添加量的平均回收率为88.6%～93.2%，方法的检出限为1.0 mg/kg。优化后的方法重复性好、准确度高、基质干扰小。通过实际样品的检测，说明该方法有较广泛的适用范围。