铁皮石斛无菌纳米粉抗慢性肝损伤及对肝组织超微结构的影响*

徐博，吴畏难，沈楠，安英

(1.吉林医药学院基础医学院，吉林 132013；2.吉林市中心医院普通外科，吉林 132011)

铁皮石斛在民间素有“救命仙草”之称，具有抗肝损伤、增强免疫、抗疲劳、抗氧化、促消化、抗肿瘤等功效[1]。由于滋阴潜阳作用和广泛的保健功效，铁皮石斛一直被视为石斛中的珍品[2-3]。本课题组前期研究表明，铁皮石斛普通粉(dendrobium officinale powders，DOP)在改善肝功能和护肝方面具有一定的疗效。但因其价格昂贵，临床应用始终受限。近年来研究的纳米中药有许多新的特点和功能，可以降低患者用药量，节约有限的中药资源，降低不良反应，提高生物利用度、靶向性，呈现新药效，拓宽原药适应证[4]。笔者采用纳米技术改变粒径大小，精制成铁皮石斛无菌纳米粉(dendrobium officinale nanoparticles，DON)，丰富了中药的剂型选择，目前文献中对其保护肝损伤在药效和机制方面的研究报道较少，因此，本实验通过建立小鼠肝损伤模型，观察DON对相关生化指标、炎症因子表达、肝脏病理及肝细胞超微结构改变等方面的影响，探讨其作用机制[2，5]，报道如下。

1 材料与方法

1.1药品与试剂 铁皮石斛(浙江铁枫堂药业有限公司)，DON[采用超临界反溶剂法联合高压蒸汽灭菌法制备，经纳米粒度仪测定平均粒径为(100±30)nm]，DOP(粒径0.425 mm)，均由北华大学药学院根据实验所需粒径要求制备并鉴定。护肝片(吉林省松辽制药公司)；四氯化碳(CCl4，天津市光复科技发展有限公司)；丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶 (AST)、乳酸脱氢酶(LDH)和过氧化氢酶(catalase，CAT)试剂盒均购于南京建成生物工程研究所；肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-6酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)；IL-1β抗体(武汉爱博泰克生物科技公司)。

1.2实验仪器与设备 SALD-7500nano纳米粒度仪(日本岛津公司)，PM100行星式球磨仪(德国Retsch公司)，酶标仪(美国伯乐公司)，HPX-9052MBE电热恒温培养箱(上海博迅医疗设备厂)，BX53正置显微镜(日本奥林巴斯公司)，Tecnai G2 Spirit透射电子显微镜(美国Thermo Fisher公司)。

1.3实验动物 清洁级昆明种小鼠40只，雌雄兼用，体质量(20±2) g，购至吉林大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK(吉)：2009-0005。室温常规饲养，相对湿度75%，每天换水1次，每天光照12 h。

1.4方法

1.4.1分组、造模和给药方法 小鼠40只，随机分为4组，分别为正常对照组、模型对照组、DON组和DOP组各10只，正常对照组灌胃给予纯化水，DON组和DOP组按相应药物剂量(0.30 mg·kg-1)给予，每天1次。造模为每周2次(星期一、星期四)，给药后1 h，除正常对照组外，各组分别皮下注射20%CCl4花生油溶液(2 mL·kg-1)，正常对照组给予同等剂量花生油溶液。给药和造模均为第1周的星期一开始给药，共8 周。末次造模药给予12 h后，采集各组小鼠血清和肝组织标本，进一步行肝功能生化指标(每组10只)、肝病理学检测及电镜观察(随机选取每组3～5只)[6]。

1.4.2检测生化指标 严格按试剂盒说明书检测AST、ALT、LDH、CAT、TNF-α及IL-6含量。

1.4.3免疫组化法检测肝组织中IL-1β的表达 取肝组织0.1 g，置10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋并切片，二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色，免疫组化法处理，具体流程按试剂盒说明书操作。晾干后置于显微镜下观察并摄像。用Motic Images Advanced 3.2版软件对免疫组化染色结果进行分析。

1.4.4苏木精-伊红(HE)染色观察小鼠肝脏组织结构改变 血液标本收集完毕，处死大鼠，取整个肝左叶，置10%甲醛溶液固定，用于制作HE 染色切片，在光学显微镜下观察肝脏病理组织学改变。

1.4.5小鼠肝脏电镜超微结构观察 同上处理，取肝右叶1 mm3，置2.5%戊二醛溶液固定，制作电镜切片(由上海赛新生物科技有限公司完成)，透射电子显微镜观察肝脏超微结构改变。

2 结果

2.1DON对小鼠血清AST、ALT、LDH、CAT活力的影响 见表1。与正常对照组相比，模型对照组AST、ALT、LDH活力显著升高(P<0.01)，CAT活力明显降低(P<0.01)；与模型对照组比较，DON和DOP组，血清 ALT、AST 、LDH水平均显著下降(P<0.05，P<0.01)，CAT活性增强(P<0.05，P<0.01)； 同等剂量下，与DOP组比较，DON组AST、ALT活力显著降低(P<0.05)，CAT活力显著升高(P<0.05)。

表1 4组小鼠血清AST、ALT、LDH、CAT活力比较 Tab.1 Comparison of the serum activity of AST，ALT，LDH and CAT among four groups of mice

2.2DON对小鼠血清TNF-α和IL-6含量的影响 见表2。与正常对照组比较，模型对照组TNF-α和IL-6含量显著增加(P<0.01)；与模型对照组比较，DON组和DOP组TNF-α和IL-6含量均明显降低(P<0.05，P<0.01)； 与DOP组比较，DON组TNF-α和IL-6含量显著降低(P<0.05，P<0.01)，DON更明显减轻肝损伤导致的炎症反应。

2.3肝组织中IL-1β的表达 见图1。IL-1β在细胞质中表达的目标蛋白为棕黄色。与正常对照组比较，模型对照组小鼠肝脏组织中 IL-1β表达明显增加(t=27.10，P<0.01)；与模型对照组比较，DON组和DOP组IL-1β表达均明显降低(t=4.28，P<0.05，t=15.63，P<0.01)；与DOP组比较，DON组IL-1β表达显著降低(t=14.33，P<0.01)。

图1 4组小鼠肝组织中IL-1β的表达 (×200) Fig.1 IL-1β expression in livers in four groups of mice(×200)

2.4DON对肝损伤小鼠肝组织病理学的影响 见图2。光镜显示，正常对照组小鼠肝组织具有完整的结构，无炎症细胞浸润，无变性或坏死，肝小叶和肝窦清晰规则且整齐排列，肝细胞呈索放射状分布于中央静脉周围； 模型对照组肝组织呈现出紊乱的肝小叶结构和肝细胞索，肝细胞肿胀变大呈圆形且大小不匀，与周围组织界限不清，有程度不同的坏死，肝细胞内可见大小不一空泡，并有气球样及水样变性，肝窦变形变窄；DON组和DOP组肝细胞细胞质水样变性及气球样变有所改善，炎症损伤、炎症细胞浸润较模型对照组均有不同程度改善，其中DON组最为明显。

图2 4组小鼠肝脏组织的病理学变化(×200) Fig.2 Pathological changes of livers in four groups of mice(×200)

表2 4组小鼠血清TNF-α和IL-6含量比较 Tab.2 Comparison of the serum level of TNF-α and IL-6 among four groups of mice

2.5DON对肝损伤小鼠超微结构变化的影响 见图3。正常对照组肝细胞结构完整，核仁明显，肝细胞质中线粒体、内质网等细胞器形态正常，结构清晰，线粒体嵴排列规整，内质网丰富；模型对照组肝细胞内质网断裂，细胞质内线粒体肿大甚至破裂或变形，数量减少，可见弥漫散在分布大小不等脂滴，部分肝细胞正常结构消失； DON组和DOP组与模型对照组比较，肝细胞的超微结构明显改善，其中DON组肝细胞结构逐渐接近正常，核周围脂滴数量及分布均有改善，仍有损伤性肝细胞结构，但肿胀线粒体少，且肿胀程度较轻，粗面内质网增多，部分轻度扩张。

图3 4组小鼠肝组织超微结构变化(×5000) Fig.3 Ultrastructural changes of livers in four groups of mice(×5000)

3 讨论

本实验结果显示，提前给予DON可显著抑制CCl4摄入所引起的血清中ALT、AST、LDH的活性升高和CAT活性降低。提示DON对小鼠受损的肝功能和肝脏组织具有改善与修复作用，且明显优于DOP。

单核细胞或巨噬细胞在CCl4作用下向肝脏积聚，致敏的巨噬细胞会释放一些炎症递质 ( 如自由基、IL-1β 和 TNF-α 等)，诱发炎症，从而造 成 肝 细 胞 损 伤。其中，TNF-α 是最关键的细胞因子之一[7]。释放细胞因子水平较低时，IL-1β的细胞生物学效应主要有两方面，其一可引起组织局部炎症反应，其二可进一步促进 IL-6 合成[8]。本实验发现，DON比DOP更显著降低TNF-α、IL-1β 水平，可能是其保护CCl4致慢性肝损伤的重要因素之一。

光镜下模型对照组肝组织发生了明显的改变，且呈弥漫性，并伴有炎细胞浸润和坏死，显示造模效果良好。用DON干预后，可见受损的肝细胞有明显修复，细胞质水样变性及气球样变有所改善，且比DOP组显著[9-10]。

透射电镜可以观察肝脏线粒体结构的损伤情况[11]，本实验结果显示，模型对照组可见线粒体出现肿胀，线粒体内峭模糊，外膜破损，空泡样改变，基质密度不同程度降低，粗面内质网减少等超微结构变化。DON组和DOP组肝细胞的超微结构改善，细胞内脂滴减少，脂滴的聚集显著减少，细胞核变圆变大。DON比DOP的抗炎作用更明显。DON对慢性肝损伤小鼠无论肝脏病理组织学还是肝细胞超微结构都表现出了一定的保护作用，这为铁皮石斛纳米化应用于临床提供了理论依据。

纳米化后的铁皮石斛具有更强的清除自由基、抗氧化、抗炎作用，肝靶向性显著增强，可清除体内大量的自由基，从而达到更好的保护肝脏细胞的作用。综上所述，无论从肝功能指标还是组织学结果分析均显示DON对肝脏的保护作用优于其未纳米化。