枣裂果生理特性与相关基因的表达分析

林敏娟 ，张晶晶 ，王建宇 ，王振磊 ，吴翠云 ，刘孟军 *

（1.河北农业大学园艺学院，河北 保定 071001；2.塔里木大学园艺与林学学院，新疆 阿拉尔 843300；3.南疆特色果树高效优质栽培与深加工技术国家地方联合工程实验室，新疆 阿拉尔 843300）

枣（Ziziphus jujubaMill.）为鼠李科枣属植物，具有抗旱、耐盐碱、生长适应性强等诸多优点，截止2017 年底，新疆枣种植面积为4.76×105hm2，产量为3.47×106t，枣已成为南疆主要的经济支柱［1］。但由于枣成熟期时常处于雨季，裂果的现象普遍存在，每年因裂果造成枣产量的损失大约为30%，严重的年份达80%以上，裂果严重影响和制约我国枣产业的可持续性发展。

枣果皮中的纤维素、半纤维素以及果胶共同组成细胞壁的网状结构，维持细胞稳定及完整性［2］。原果胶为果胶中的主要成分，细胞壁结构被破坏主要是因为纤维素酶及果胶酶可将无定形纤维素和原果胶水解为纤维寡糖和小分子物质，致使果皮强度降低，裂果率升高［3，4］。易裂西瓜瓜皮中的果胶酶、纤维素酶及POD 活性显著高于抗裂的小型西瓜［5］。易裂品种壶瓶枣［6］的原果胶及纤维素含量在果实发育后期降低，裂果率升高。

果实内部遗传因素也是引起果实裂果的重要因素之一，果实内部基因变化可能引起果实结构及硬度的变化，细胞壁扩张蛋白是与裂果关系较为密切的细胞壁代谢相关基因［7］，抑制番茄PG和EXP基因表达可使PG 和EXP 蛋白含量降低，果皮中水溶性果胶含量减少，细胞壁厚度及硬度均增加，裂果率降低［8］。辛海清［9］研究发现抗裂枣品种‘皖枣3 号’果皮中扩张蛋白EXPA类基因表达量显著高于枣易裂果品种‘李府贡枣’。魏琦琦［10］发现PG和LOX基因可能与中秋酥脆枣裂果有关。

目前关于枣裂果研究多数集中在果皮解剖结构、细胞壁物质含量、植物内源激素等生理生化方面，本课题组研究通过对伏脆蜜不同裂果部位进行转录组测序分析，得到5 个差异表达基因（AUX/IAA、ARF、SAUR、JAZ、GH3.1）主要调控植物激素信号转导；2 个差异表达基因（Endo⁃glucanase12、Pectinesterase17）调控纤维素酶及果胶酶活性；3 个差异表达基因（POD17、POD4、POD51）主要富集合成木质素［11］。这 10 个基因可能与‘伏脆蜜’裂果有关，但研究还不够深入、系统，生理生化指标与裂果基因关系的研究鲜有报道。因此，本试验以‘伏脆蜜’为试材，进行实时荧光定量分析，探讨‘伏脆蜜’裂果发生前后果皮中纤维素、半纤维素、果胶含量，纤维素酶、半纤维素酶、POD 活性，IAA、ABA 及 GA3含量与基因表达的关系，为枣裂果分子机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2019 年在塔里木大学枣种质资源圃进行，供试品种为易裂果品种‘伏脆蜜’，树龄10 年，田间常规管理，水肥管理条件一致。盛花后40~50 d 为枣果绿熟期，此时期枣果还未定型；盛花后60~70 d 左右为枣果白熟期；盛花后80 d 左右为果实脆熟期；盛花后90 d 枣果实全红；盛花后70~80 d 为“裂果初发期”，盛花后80~90 d 为“裂果高发期”，盛花后90 d 为裂果末期。

1.2 试验方法

选择6 株长势大致相同的枣树，2019 年6 月枣树盛花期对树冠外围、生长健壮枣吊中部的花进行挂牌标记，盛花期后40 d 起，每隔10 d 从东南西北每个方向采摘15 个完好无损的果实，用蒸馏水清洗干净，取果皮，液氮快速冷冻后装入自封袋，−80℃超低温保存备用。

1.2.1 细胞壁物质含量测定

纤维素、半纤维素含量采用蒽酮比色法，果胶物质含量采用咔唑硫酸比色法［11］。

称取2 g 果皮，液氮研磨，80%乙醇定容至10 mL，沸水浴煮 20 min，室温冷却，于 6 000 r·min-1离心10 min，弃上清液（重复5~6 次），直至提取液中检测不到糖为止，用10 mL 90%的二甲基亚砜于4℃浸泡15 h 以除去淀粉，加入10 mL 氯仿∶甲醇（1∶1）冲洗滤渣，再用 10 mL 丙酮重复离心，洗涤沉淀，于45 ℃下干燥至恒重，得到粗细胞壁，用于测定纤维素、半纤维素、果胶物质含量。

1.2.2 细胞壁代谢酶活性测定

POD 活性测定采用愈创木酚氧化法，纤维素酶和果胶酶活性测定采用DNS 终止反应法［11］。

POD 活性测定：取果皮0.5 g 置于研钵中，加入 2.5 mL 0.1 mol·L-1pH 7.2 的 磷 酸 缓 冲 液 ，少量石英砂以及聚乙烯吡咯烷酮研磨成匀浆，转入10 mL 离心管中，用2.5 mL PBS 冲洗研钵2~3次，合并提取液，于 4 ℃，5 000 r·min-1离心 15 min获得粗酶液。

纤维素酶和果胶酶活性测定：取枣果皮1 g 置于研钵中，加 1 mL 预冷的 0.1 mol·L-1pH 7.6 的醋酸钠缓冲液冰浴研磨成匀浆，匀浆倒入10 mL离心管中，用醋酸缓冲液依次加1 mL 冲洗3 次，4 ℃提取 1 h，4 ℃1 000 r·min-1离心 20 min 得上清液（粗酶液）。

1.2.3 内源激素的测定

采用高效液相色谱法［12］测定枣果皮中IAA、ABA、GA3含量，略有改动。

1.2.4 基因表达量的测定

使用TIANGEN 公司的RNAprep Pure Plant Plus Kit（Polysaccharides&Polyphenolices-rich）提取枣果皮中总RNA，用RNase-Free DNase I（TIANGEN，中国）处理去除基因组DNA，按照FastQuant RT Super Mix FastQuant cDNA 试剂盒（TIANGEN，中国）说明书将RNA 进行反转录，合成 cDNA。按照 SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）（TIANGEN，中 国）试 剂 盒 和 使 用QUANT 5 定 量 PCR 进行 qRT-PCR 反应。

SuperReal PreMix Plus（SYBR Gree）试剂盒反应体系如下：2×SuperReal PreMix Plus 5 μL，F-primer 0.3 μL，R-primer 0.3 μL，cDNA 1 μL，RNase-Free ddH2O 10 μL，按照程序：95 ℃ 15 min预变性，95 ℃ 15 s 变性，60 ℃ 20 s 退火，72 ℃ 20 s延伸，40 个循环。每个基因重复3 次。使用2-△△CT法计算出基因相对表达量。PCR 特异性引物和内参基因引物见表1。

表1 相关基因qRT−PCR 引物序列Table 1 Primer sequences of related genes QRT−PCR

1.3 统计分析

采用 Microsoft Excel 2010 和 DPS 7.55 软 件对数据整理作图及分析，用多重比较中的Duncan新复极差测验法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 枣果实发育过程中果皮细胞壁物质含量的变化

如图1 所示，在枣果实发育过程中果皮中纤维素、WSP、ISP 和总果胶含量呈‘W’型变化趋势（图1A、B、C、D）。裂果初发期呈下降趋势，在裂果高发期呈上升趋势，裂果末期纤维素、ISP 及总果胶含量最高，分别是3.60%，2.19%，6.74%。半纤维素（图1E）含量在裂果初发期含量最高0.71%，裂果末期半纤维素含量相比裂果初发期降低44%。 CSP（图1F）含量在白熟期含量最低1.84%，在裂果高发期含量变化较为平稳。这表明细胞壁物质含量与裂果关系较为密切。

图1 枣果实发育过程中果皮细胞壁物质含量变化Fig.1 Changes of pericarp cell wall substance content during fruit development of Jujube

2.2 枣果实发育过程中果皮细胞壁代谢酶活性变化

如图2 所示，在裂果发生前后，POD 在盛花期后 50 d 和 70 d 时酶活性高达 89.91 U·g-1和 86.41 U·g-1，裂果期酶活性快速降低。纤维素酶在盛花期后 70 d 酶活性最大，为 2 363.47 U·g-1，裂果期酶活性逐渐降低，裂果末期酶活性相比裂果初期酶活性降低25.01%。果胶酶活性在裂果发生前后变化不大。

图2 枣果实发育过程中果皮细胞壁代谢酶活性变化Fig.2 Changes of metabolic enzyme activity of pericarp cell wall during fruit development of Jujube

2.3 枣果实发育过程中果皮激素含量变化

如图3 所示，裂果发生前后GA3含量在裂果发生前后呈‘上升-下降’的趋势，白熟期GA3含量最高，高达 173.72 ng·g-1，整个裂果期间 GA3含量降低了27.62%；盛花后90 d IAA 含量相比盛花后40 d 下降了79.74%；ABA 含量在裂果发生前后变化较为平稳。

图3 枣果实发育过程中果皮激素含量变化Fig.3 Variation of hormone content in pericarp of Jujube during fruit development

2.4 调控果皮细胞壁代谢酶及内源激素的基因表达量变化

2.4.1 枣果实发育过程中调控果皮POD 活性的基因表达量变化

如图4 所示，随着‘伏脆蜜’果实开始开裂，枣裂果时期调控相关POD 活性的POD17、POD4、POD51三个基因表达量显著低于未裂果时期，裂果末期基因表达量相比与裂果初期基因表达量相比，分别降低76.05%、98.11%、95.49%。

图4 枣果实发育过程中相关POD 基因表达量分析Fig.4 Analysis of POD gene expression levels during fruit development in Jujube

2.4.2 枣果实发育过程中调控果皮细胞代谢酶的基因表达量变化

如图5 所示，Endoglucanase12基因在盛花期后70 d 基因表达量为5.97，裂果时期基因表达量直线下降。Pectinesterase17基因在盛花后80 d 和90 d 的基因表达量分别是盛花后70 d 基因表达量的 17.98 倍 和 15.69 倍 。

图5 枣果实发育过程中细胞代谢酶相关基因表达量分析Fig.5 Analysis of expression levels of metabolic enzymes related genes in Jujube fruit development

2.4.3 枣果实发育过程中调控果皮激素信号转导的基因表达量变化

如图 6 所示，调控ARF、JAZ、SAUR的基因表达量在裂果初期表达量最高，表达量分别为4.17、2.39、6.27。在裂果高发期3 个基因表达量迅速下降且维持在较低水平。AUX/IAA和GH3.1基因表达量在未裂果时期基本未发生变化，在裂果期2个基因表达量快速上升，分别在盛花后90 d 和80 d基因表达量达到最大值。

图6 枣果实发育过程中相关激素信号转导基因表达量分析Fig.6 Analysis of expression levels of related hormone signal transduction genes during fruit development in Jujube

3 讨论

3.1 细胞壁物质与裂果的关系

原果胶、纤维素、半纤维素等多糖类物质共同构成植物细胞的细胞壁［13］。原果胶含量、纤维素排列方式和半纤维素网络结构均可增强细胞壁强度、韧性以及延展性［14］。随果实生长发育，原果胶可降解为水溶性果胶，原果胶含量降低，抗裂品种‘婆婆枣’CSP、WSP 及ISP 含量极显著高于易裂品种‘壶瓶枣’［15］。本研究发现‘伏脆蜜’裂果期果皮中CSP 含量无显著变化，裂果初期枣果皮中WSP、ISP 及总果胶含量下降，裂果高发期上升。裂果期半纤维素降低，与赵丽琴［2］的研究结果一致。

3.2 细胞壁代谢酶及相关基因与裂果的关系

POD 为细胞壁氧化酶，主要与植物组织分化和果实成熟等有关。POD 可通过催化各种木质醇单体发生脱氢聚合反应，参与细胞壁内木质素合成［16］。较高木质素会导致细胞壁木质化程度增加，延展性降低，裂果率增加。易裂品种壶瓶枣果实中POD 活性随枣果生长发育呈下降趋势［6］，本研究发现‘伏脆蜜’裂果期果皮中POD 活性，富集合成木质素的POD17、POD4、POD51基因表达量快速下降，此3 个基因可能相互调控POD 活性。纤维素酶及果胶酶可水解果皮中的纤维素及果胶从而降低果皮的机械强度，导致果实的易裂性［17］。裂果期‘伏脆蜜’枣果皮中纤维素酶活性显著下降，与栗现芳在“骏枣”上的结果一致［18］。调控纤维素酶活性基因Endoglucanase12表达量在裂果期快速下降。此基因可能在纤维素降解过程中扮演重要角色，从而导致纤维素含量改变。果胶酶可通过分解细胞壁中果胶影响细胞壁稳定性，导致裂果增加。易裂荔枝品种“糯米滋”果胶酶活性较高［19］，而‘伏脆蜜’果皮中果胶酶活性白熟期至裂果期下降幅度较小。果胶甲酯酶基因在骏枣果实中表达量较高［20］，‘伏脆蜜’枣果皮中调控果胶酶活性的Pectinesterase17基因裂果期表达量极显著高于未裂果期。

3.3 激素信号转导及相关基因与裂果的关系

生长素、赤霉素是生长促进类激素，在果实生长发育前期可加速细胞的分裂生长速度，脱落酸是生长抑制激素，调控植物器官衰老发育进程［21］。果实裂果与生长素、赤霉素、脱落酸密切相关。枣果实发育前期高含量IAA 及GA3可促进细胞分裂及生长，而果皮细胞在果实发育后期停止生长，果肉细胞易吸水膨胀，导致裂果［22］。杨俊强［23］研究发现易裂品种‘壶瓶枣’内源GA3含量显著低于抗裂品种‘官滩枣’。随着枣果生长发育成熟，高含量ABA 可加速细胞衰老，果皮组织软化导致裂果，易裂品种‘骏枣’ABA 含量在裂果高发期显著高于抗裂品种‘圆铃枣’［24］。本研究发现盛花期后60~90 d‘伏脆蜜’果皮中GA3及IAA 含量呈下降趋势，ABA 含量裂果前后变化不大。

JA（茉莉酸）是一类新型与自身防御系统有关的植物内源生长物质，在受到外界不利因素侵害时，可诱导植物防御基因表达以及防御化学物质的合成［25］。杨育［13］在梨上研究发现编码JA合成关键酶及生长素AUX/IAA转录因子的基因在裂果果皮中下调表达，裂果果皮中GH3转录因子和SAUR转录因子的基因与正常果皮相比上调表达。本研究发现‘伏脆蜜’枣裂果期JAZ、ARF、SAUR下调表达，AUX/IAA、GH3.1上调表达。

4 结论

POD17、POD4、POD51、Endoglucanase12、JAZ、ARF、SAUR基因表达量在裂果期快速下降，裂果期Pectinesterase17、AUX/IAA、GH3.1表达量极显著高于未裂果期。POD、纤维素酶活性在枣裂果期快速下降，纤维素酶加速纤维素及半纤维素分解，纤维素含量在裂果初期下降，半纤维素含量在裂果期快速下降，细胞壁稳定性变差，裂果增加，POD17、POD4、POD51、Endoglucanase12低表达与‘伏脆蜜’POD 及纤维素酶活性密切相关。Pectinesterase17与果胶酶的关系还有待进一步研究。果皮中GA3及IAA 含量在裂果期下降，而ABA 含量上升，激素与相关基因之间的具体关系仍需进一步验证。