小黑杨ERF723 基因的克隆、表达及生物信息学分析

2021-12-28刘霖许睿儿程紫涵王雪怡高原周博如

山西农业大学学报（自然科学版） 2021年6期

刘霖，许睿儿，程紫涵，王雪怡，高原，周博如

（东北林业大学林学院/林木遗传育种国家重点实验室，黑龙江哈尔滨 150040）

土壤盐渍化是影响全球农业生产的主要非生物胁迫之一［1］，过量的盐分可以通过渗透胁迫、离子毒害等途径改变植物的细胞膜透性减少植物对营养元素的吸收，并造成植物生理代谢的紊乱，影响植物的生长发育［2］。植物在自然条件下经常遭受干旱、盐碱和极端温度等非生物胁迫，导致植物生长矮小、产量降低、甚至死亡［3］。植物在遭受极端温度和干旱胁迫时，会造成植物蛋白质变性、引起活性氧发生等破坏细胞成分，对植物生长发育产生不利影响［4，5］。因此，分析植物应答不同胁迫机制对于培育抗逆植物具有重要意义。

在非生物胁迫长期协同进化过程中植物演化出多种生存机制，一些基因会产生应答反应降低胁迫造成的伤害，从而适应恶劣的环境［6，7］。转录因子（transcription factor，TF）又称反式作用元件，是细胞活动的主要调控因子，可以在不同的胁迫条件下，与植物体内启动子中的顺式作用元件特异性结合调控应答基因，进而刺激被调控基因转录表达提高植物的抗逆能力［8］。例如，在菊花中过量表达CmERF053 基因增加了转基因菊花的侧芽和不定根，提高其抗旱能力［9］；在 84K 杨树中过表达ERF38基因可以与DRE 元件特异性结合应答干旱和高盐胁迫［10］。植物特异性转录因子AP2/ERF 家族是植物中最大的转录因子家族之一。ERF 转录因子在AP2/ERF 转录因子家族是一个主要的分支。近年来，ERF 转录因子得到广泛关注，在拟南芥［11］、水稻［12］、油菜［13］、大豆［14］和杨树［15］等植物中均有关于ERF 家族转录因子的研究报道。许多研究表明，ERF 家族转录因子在激素信号转导［2，16］、生物和非生物胁迫反应［17，18］、植物发育［19］以及代谢调节［20，21］中发挥关键作用，具有较高的研究价值。

小黑杨（Populus simonii×P. nigra）具有生长速度快、抗寒、抗旱、抗病虫害等优良特性，特别是在黑龙江西部干旱、寒冷地区长势很好，可作为我国北方沙荒、干旱地区优良的树种，被广泛用于植物遗传转化及植物抗逆性的研究［22，23］。本研究利用团队前期获得的耐盐相关小黑杨转录组数据［15］，从小黑杨中克隆了盐胁迫持续上调的基因ERF723，并对其进行生物信息学分析；对ERF723-GFP 融合蛋白进行亚细胞定位分析；用qRT-PCR（Quantitative Real-time PCR）分析在不同胁迫处理下ERF723基因在小黑杨各组织中的表达特性，为明确ERF723基因在小黑杨中抗逆胁迫机制和生物功能提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料和目的基因的克隆

以生长一个月的小黑杨、烟草为材料，利用天恩泽柱式植物RNAout 试剂盒（北京天恩泽科技有限公司）提取野生型小黑杨根部RNA，并用PrimerScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara，Dalian，China）将其反转录为 cDNA。通过Phytozom 网站查找小黑杨ERF723基因在毛果杨（P. trichocarpa）中同源基因PtrERF723的基因序列，并设计引物（ERF723-F：5’-ATGGAT GCCTCCATCTTTCA-3’，ERF723-R：5’-TCA CCAAGGACTCGTAGCCT-3’）。以小黑杨根部cDNA 为模板对ERF723基因进行扩增，琼脂糖凝胶电泳得到目的条带后进行胶回收实验，并将胶回收产物与pMD19-T Vector 载体连接转化至大肠杆菌中，挑取单菌落进行PCR 检测，将扩增出正确条带的菌液送到生工生物工程公司进行测序，保存正确的菌液于−80℃冰箱中，为后续试验做准备。

1.2 ERF723 生物信息学分析

通过 NCBI（https：//blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi？PROGRAM=blastp）查找在不同物种中与ERF723 蛋白同源性较高的氨基酸序列，并使用 MEGA7.0 构建进化树［24］，通过 Clustal W 程序对其氨基酸序列进行多序列比对［25］。

通过 ProtParam tool（https：//web. expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam）分析 ERF723 蛋白的理化性质，并通过 ProtScale（https：//web.expasy. org/cgi-bin/protscale/protscale）预测ERF723 蛋白的疏水性。利用 TMPred（http：//www. ch. embnet. org/software/TMPRED_form.html）预测该蛋白的跨膜结构。通过Singa-P 4.1（http：//www. cbs. dtu. dk /services /SignalP）预测其信号肽，通过 NetPhos 3.1（http：//www.cbs.dtu. dk/services/NetPhos/）预测其磷酸化位点。通过 SOPMA（https：//npsa-prabi. ibcp. fr/cgibin/npsa_automat. pl？ page=/NPSA/npsa_sopma. html）分析ERF723 蛋白的二级结构。利用SWISS-MODEL （https：//swissmodel. expasy.org/interactive）对其三级结构进行预测。通过ProtComp 对ERF723 蛋白的亚细胞定位进行预测。

1.3 构建ERF723-GFP 载体及亚细胞定位

根据ERF723基因的ORF 序列，设计同源融合引物（ERF723-GFP-F：5’-GGGTCGACTG ACTAGTATGGATGCCTCCATCTTTCA-3’，ERF723-GFP-R：5’-TGCTCACCATACTAGTC CAAGGACTCGTAGCCTTTC-3’）。以pMD19-T-ERF723 质粒为模板进行PCR 扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳及胶回收实验。通过限制性内切酶SpeⅠ对pBI121-GFP 载体质粒进行酶切，利用In-Fusion 酶对酶切后的pBI121-GFP 载体与目的基因进行同源融合，将产物转入至大肠杆菌中，待长出单菌落后用载体引物（GFP-F：5’-CCATC GTTGAAGATGCCTCTGC-3’，GFP-R：5’-TCGACCAGGATGGGCACCAC-3’）进行 PCR检测，将菌液并送至生物公司测序，提取ERF723-GFP 融合表达载体质粒备用。

无菌水和NaClO 消毒液按4∶1 的比例配制消毒剂，取适量烟草种子浸泡其中，随后用无菌水清洗5~7 次。将消毒后的种子平铺在MS 培养基上，待一周后将长出的烟草幼苗移栽到土盆中，继续培养一个月左右。将ERF723-GFP 质粒转入到农杆菌中，并在LB 液体培养基（含50 mg·L-1利福平和50 mg·L-1卡那霉素）中培养至OD600为=1.0左右，用重悬液重悬菌体，将其注射到烟草叶片的下表皮中。暗培养36~48 h 后，在激光共聚焦显微镜（LSM 700，Zeiss，Germany）下观察 ERF723-GFP 融合蛋白的表达部位。

1.4 ERF723 基因时空表达分析

将1 月龄的小黑杨组培苗，置于相对湿度为60%~70%、16 h 光/8 h 暗、平均温度 25 ℃中水培1 个月。对小黑杨进行干旱、150 mmol·L-1NaCl和 4℃胁迫处理，并在 0、3、6、24、48 h 时间点提取小黑杨的根、茎、叶样品，提取其RNA 并将其反转录为cDNA。通过NCBI 网站分析ERF723基因的保守结构域，并设计实时荧光定量PCR 的引物（F：5’-GAAGCAGGGGCAAGAAAGAG-3’；R：5’-ACTCGTAGCCTTTCCAGATG-3’）。以内参引物ACT 为对照，进行实时荧光定量qRT-PCR，通过 2−ΔΔCt法［26］计算小黑杨ERF723基因在不同胁迫条件下根、茎、叶中的相对表达量。小黑杨在各个胁迫后处理的每个时间点取样均包含3 个生物重复。

2 结果与分析

2.1 ERF723 基因克隆与载体构建

通过小黑杨的cDNA 为模板进行PCR 扩增并连接pMD19-T Vector 载体，扩增出一条663 bp 的条带如图1A。ERF723-GFP 融合表达载体通过载体引物（GFP-F：CCATCGTTGAAGAT GCCTCTGC，GFP-R：TCGACCAGGATGGGC ACCAC）进行验证，条带位于1 000 bp 左右如图1B，表明构建ERF723-GFP 载体成功。

图1 小黑杨ERF723 基因相关PCR 检测Fig.1 PCR correlation of transcription factor ERF723 from Popu⁃lus simonii×P.nigrar

2.2 ERF723 蛋白同源性分析

通过NCBI 查找在不同物种中与小黑杨ERF723 蛋白同源性较高的植物，通过Bioedit 软件进行多序列比对如图2，通过MEGA7.0 进行系统发育树构建如图3。小黑杨ERF723基因的氨基酸序列与毛果杨（Populus trichocarpa）、长梗柳（Salix dunnii）高度同源，相似度高达 100% 和91.04%，其次与蓖麻（Ricinus communis）、橡胶树（Hevea brasiliensis）、木薯（Manihot esculenta）、麻疯树（Jatropha curcas）、木油桐（Vernicia montana）亲缘关系较近，而与白桦（Betula platyphylla）、土瓶草（Cephalotus follicularis）、番木瓜（Carica pa⁃paya）雷公藤（Tripterygium wilfordii）亲缘关系较远。

图2 ERF723 蛋白的同源氨基酸序列多重比对Fig.2 A Multiple alignment of homologous amino acid sequences of ERF723 protein

图3 不同物种中ERF723 同源蛋白的系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of ERF723 homologous proteins from different species

2.3 ERF723 蛋白生物信息学分析

通过EXPLASy 对ERF723 蛋白质序列进行基本理化性质分析，ERF723基因编码的蛋白质由221 个氨基酸组成，蛋白分子式C1084H1697N315O345S9，含3 450 个原子，氨基酸分子质量为24 950.84，理论等电点 PI 值（Theoretical pI）为 6.85，脂肪系数（Aliphatic index）为62.26，不稳定系数（Instability index）为 57.51，为不稳定蛋白。通过 ProtScale 分析该蛋白可能是亲水性蛋白（图4A）。运用SOPMA 预测ERF723 蛋白的二级结构，组成ERF723蛋白的221 个氨基酸中，其中80 个氨基酸可能形成 α-螺旋（Alpha helix），占 36.20%；17 个氨基酸可能形成延伸链（Extended strand），占7.69%；12个氨基酸可能形成β-转角（Beta turn），占5.43%；112 个氨基酸可能形成无规则卷曲（Random coil），占50.68%。通过 Singa-P 预测ERF723 蛋白不存在信号肽（图4B）。利用NetPhos 3.1 对ERF723的磷酸化位点进行预测（图4C），表明ERF723 含有丝氨酸（Serine）位点 22 个，苏氨酸（Threnine）位点 6 个，酪氨酸（Tyrosine）位点 1 个。利用 TMpre预测ERF723 蛋白不存在跨膜结构（图4D）。通过SWISS-MODEL 对其蛋白三级结构进行预测，结果如图5。

图4 小黑杨ERF723 蛋白的生物信息学分析Fig.4 Bioinformatics analysis of ERF723 protein of Populus simonii× P.nigra

图5 ERF723 蛋白的三级结构预测Fig .5 Prediction of tertiary structure of ERF723 protein

2.4 ERF723 蛋白的亚细胞定位

将ERF723-GFP 融合表达载体和pBI121-GFP 载体对烟草进行瞬时转化，结果如图6 所示。在激光共聚焦显微镜488 nm 处观察到EGFP 显示为绿色荧光，而阳性对照pBI121-GFP 载体在细胞核、细胞质、细胞膜中见有绿色荧光，说明pBI121-GFP 载体在整个细胞中均有表达，而ERF723-GFP 融合表达载体仅在细胞核内可见绿色荧光，由此说明ERF723 蛋白定位于细胞核中与ProtComp 预测结果一致。

图6 小黑杨ERF723 蛋白的亚细胞定位Fig.6 Subcellular localization of ERF723 protein in Populus simonii× P.nigra

2.5 ERF723 基因的时空表达分析

qRT-qPCR 数据分析表明（图7），经干旱胁迫处理小黑杨后ERF723基因在根中呈上调表达趋势，在处理48 h 后表达量达到峰值，高达对照表达水平的69.2 倍；在茎中的表达量呈现先上升后下降的趋势，ERF723基因在茎中3 h 表达量出现最大值，表达量为对照表达水平的15.4 倍；与茎和根中的表达量相比，ERF723基因在叶片中的诱导表达不明显。

图7 小黑杨ERF723 基因在不同胁迫条件下的时空表达分析Fig.7 The temporal and spatial expression analysis of Populus simonii× P.nigra ERF723 gene under salt stress conditions

经 150 mmol·L-1NaCl 溶液处理后ERF723基因在小黑杨茎和根中的相对表达量均呈现出上调趋势，尤其是在根中表达尤为显著，在48 h 盐胁迫后表达量达到最高，为对照表达水平的49.2 倍。而ERF723基因在茎中的表达量持续上调在48 h达到峰值，为对照表达水平的16.2 倍；而与根茎相比，虽然ERF723基因在小黑杨叶中的表达量在24 h 达到最高值，但仅为对照表达水平的4.0 倍，其后表达量水平开始下降。

经4 ℃低温处理小黑杨后ERF723基因在根和茎中的表达量均呈现先升高后下降的趋势，在处理24 h 后根中ERF723基因表达量为对照表达水平的11.1 倍，随后表达量开始下降；在茎中处理6 h 后ERF723基因表达量达到4.9 倍；而在叶中ERF723基因的表达量在6 h 仅达到对照表达水平的2.1 倍。以上结果表明ERF723基因对干旱、高盐和低温（4 ℃）胁迫具有明显的应答反应，根部对应答胁迫反应有显著变化。

3 讨论

近年来植物在逆境胁迫下通过转录因子调控相关靶基因表达已成为研究热点。而AP2 /ERF家族转录因子在调节植物生物、非生物胁迫中发挥着重要的作用。由于ERF 转录因子家族含有一个单一的 AP2/ERF 结构域［27］，其 N-端是由高度保守的19~20 个碱性YRG 基元组成的YRG 区，可能与DNA 结合有关，而C-端是有42~43 个氨基酸残基组成的RAYD 区，可与其他蛋白互作来调控 DNA 结合域［28，29］。其家族转录因子成员具有可塑性和个体成员特异性，能有效的为基因工程和作物育种提供价值靶点［30］，是改良植物遗传特性的优良基因家族。

本研究利用前期获得的耐盐相关小黑杨转录组数据，从中筛选出耐盐小黑杨品种中对盐胁迫响应明显的基因ERF723。而有关 ERF723 基因编码的蛋白信息以及该基因对小黑杨胁迫的响应尚未报道，因此明确该基因编码蛋白质的特性、亚细胞定位以及在应答干旱、高盐和低温胁迫的基因表达模式，对进一步探究该基因在渗透胁迫中的功能具有重要意义。本实验主要以小黑杨为原材料，克隆ERF723基因，小黑杨ERF723基因编码663 bp，属于ERF 转录因子家族，编码221 个氨基酸。ERF723 为不稳定的亲水性蛋白，且没有信号肽，ERF723 蛋白定位于细胞核内。通过系统发育分析说明小黑杨ERF723 与毛果杨蛋白亲缘关系最为接近，表明同属之间蛋白同源性更高，ERF723 蛋白在进化过程中高度保守。研究表明，ERF723 蛋白共有29 个氨基酸磷酸化位点，推测ERF723基因可能经过蛋白磷酸化修饰后，具备响应逆境胁迫的生物学功能。

ERF 转录因子在植物中参与不同的信号调节途径。例如，樱桃PpcERF5基因在低温、干旱、H2O2和 ABA 胁迫条件下均有差异性表达［31］；过表达番茄TSRF1基因能提高 ABA 生物合成相关基因SDR的表达，提高对干旱胁迫的耐受性［32］；小黑杨中过表达ERF76基因后可以引起植物激素脱落酸（ABA）和赤霉素（GA）相关基因的上调表达，从而提高小黑杨的耐盐性［33］。本研究对野生型小黑杨进行干旱、150 mmol·L-1Nacl 胁迫和 4 ℃冷处理后取根、茎、叶进行实时定量PCR 分析发现，小黑杨ERF723可被干旱、高盐和低温胁迫显著诱导表达，在根、茎、叶中呈现出诱导初期表达先上升后下降、相对稳定或持续上升的趋势，表明该基因可能会在环境变化时有瞬间对其响应或长期适应的过程。小黑杨ERF723基因在应答干旱、高盐和低温胁迫上具有明显的组织特异性，在根中的相对表达量明显高于茎和叶。推测该基因可能参与植物渗透胁迫，与增强植物抗逆性有关。