小黑杨MYB32 基因生物信息学及应答盐胁迫分析

顾咏梅，夏鑫慧，王宇婷，贾丰璘，姜廷波，周博如

（东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 150040）

杨树是一种重要的木本植物，广泛分布于温带和寒温带地区，是一种具有经济和生态价值的工业原料来源，是我国北方重要的造林树种，盐碱化、寒冷、干旱等非生物胁迫是限制其生长发育的主要因素［1］。转录因子是植物信号转导途径对环境胁迫如干旱、盐碱等的主要调节因子［2］。作为数量最多的转录因子家族之一，MYB 转录因子广泛分布于真核生物中［3］。随着玉米中MYB 家族基因的首次发现，人们对其研究日益深入。现已从拟南芥、水稻、玉米、大豆等植物中鉴定出了多种MYB 家族的转录因子［4~7］。

由氨基酸残基组成的结构域是大多数的MYB 蛋白所共有的，根据其所含结构域的数目的不同，可将其划分为 4 个亚类［8］：1R-MYB；R2R3-MYB；3R-MYB 和 4R-MYB。R2R3-MYB 转录因子是MYB 家族中最大的亚家族，目前杨树基因组中发现有192 个基因编码R2R3-MYB 转录因子［9］。以往研究发现R2R3-MYB 在调节植物的初级代谢和次级代谢、植物生长发育和细胞分化等生理过程以及对生物和非生物胁迫的响应中起着重要的作用［10~12］。在拟南芥中AtMYB96基因可增强植株的抗旱和抗病能力，干旱条件下该基因促进植株表皮合成蜡质并参与水杨酸和脱落酸介导的抗病信号传递［13］。MYB6在杨树中能正调控单宁和花青素的合成，同时抑制木质素的代谢通路［14］。PagMYB73在盐和渗透胁迫条件下，在不同组织中均显示出前期表达水平逐渐提高、随后渐渐恢复的表达模式，且PagMYB73基因可以提高盐胁迫条件下植物清除活性氧能力和脯氨酸积累，增强其耐盐胁迫能力［15］。本研究对小黑杨MYB32的基因和氨基酸序列进行了生物信息学分析，明确了该基因的理化性质和蛋白质结构，克隆并鉴定了该基因上游的启动子序列，预测了其顺式作用元件的种类信息，探究了该基因应答非生物胁迫的表达特点，为探明其生物学机制提供理论依据，为后续杨树抗逆性和木材性状的育种改良奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验材料为本实验室培育的小黑杨（Populus simonii×P. nigra）双单倍体的无性系，将生长周期为1 个月且长势相近的小黑杨组培苗整理干净后，置于相对湿度60%~70%、光周期16 h 光/8 h暗、平均温度25 ℃条件下，在水中继续培养15 d 左右，用 150 mmol·L-1NaCl 溶液处理（高盐胁迫处理组均包含3 个生物学重复），分析在盐胁迫下MYB32基因的相对表达趋势。

1.2 试验方法

1.2.1 目的基因的克隆

使用CTAB 方法提取实验室野生型小黑杨的RNA，并将其反转录成cDNA；在网站Phytozome（https：//phytozome. jgi. doe. gov/jbrowse/index.html）查找毛果杨中MYB32基因的序列，并设计引物 MYB32F、MYB32R（表 1），以上述 cDNA 为模板扩增目的序列。通过CTAB 方法提取小黑杨的DNA，调取毛果杨中MYB32基因上游约2000 bp 的启动子序列，根据序列信息设计引物QDZMYB32F、QDZ-MYB32R，以小黑杨的 DNA 为模板扩增目的序列。分别获得目的条带后经琼脂糖凝胶电泳得到胶回收产物，将其分别与载体pMD19-T Vector 连接后，对连接产物利用大肠杆菌热激法进行转化。通过蓝白斑筛选，确定阳性克隆菌落，经PCR 验证后送公司测序。

表1 MYB32 基因引物Table 1 Primers for MYB32 gene

1.2.2MYB32基因及启动子的生物信息学分析

在线软件 NewPLACE（https：//www.dna.affrc. go. jp/PLACE/？ action=newplace） 预 测MYB32基因启动子序列中的顺式作用元件。

利用在线软件Bioxm 查找MYB32的开放阅读框（ORF）；利用 ExPASy（http：//web. expasy.org/cgi-bin/protparam/）分析氨基酸的理化性质［16］；使 用 ProtScale（https：//web. expasy. org/protscale/）中 的 Kyte and Doolittle 算 法 分 析MYB32蛋白的是否亲水；使用SignalP 5.0（http：//www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/）对MYB32的氨基酸序列进行信号肽的预测；利用TMHMM Server v. 2.0（http：//www. cbs. dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）预测MYB32蛋白是否具有跨膜结构域。通过SOMPA（https：//npsaprabi. ibcp. fr/cgi-bin/npsa_automat. pl？ page=npsa_sopma. html）在线分析MYB32蛋白的二级结构。在线预测软件Swissmode（https：//swissmodel. expasy. org/interactive）预 测MYB32蛋 白的三级结构［17］。在线预测软件 Yloc（http：//abi.inf. uni-tuebingen. de/Services/YLoc/webloc. cgi）预测MYB32蛋白表达位置［18］。

NCBI 数 据 库 中 Blast（https：//blast. ncbi.nlm. nih. gov/Blast. cgi？ PROGRAM=blastp）查找与MYB32编码氨基酸同源的序列，在不同物种中挑出9 条同源性较高的序列，并利用MEGAX中Neighbor-Joining Tree 建法绘制系统进化树。利用BioEdit 软件输入上述10 条氨基酸保守序列进行多序列比对。

1.2.3 基因时空表达的分析

取四周龄的小黑杨组培苗，于相对湿度60%~70%、光照15 h/暗处理9 h、温度25 ℃左右的条件下，继续水培15 d。用150 mmol·L-1NaCl处理 0、3、6、12、24、48 h（每个处理均包含 3 个生物学重复）［18，19］，将样本的根、茎、叶经液氮处理后−80 ℃保存。

使用CTAB 法分别提取样本RNA 后进行反转录。根据MYB32基因的序列信息，在非保守结构域处设计荧光定量引物QPCR-MYB32F、QPCR-MYB32R，以 Action 为内参引物（表 1），使用Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System进 行 荧 光 定 量 PCR，其 结 果 利 用 2-ΔΔCt算 法 进 行计算［20］。

1.2.4 亚细胞定位检测

根据MYB32的序列信息，设计含有SpeI 酶切位点的酶切引物（表1）。将pMD19-T-MYB32 质粒引入酶切位点，将PBI121-GFP 载体质粒于37℃条件下用限制性内切酶SpeI 进行酶切。将载体酶切产物与加入酶切位点的基因产物，于50 ℃条件下用InFusion 连接酶反应30 min，将其通过热激法转化，得到目的质粒PBI21-MYB22-GFP。将重组质粒和PBI121-GFP 空载质粒分别转入农杆菌感受态GV3101 中，将含有重组表达载体和空载的农杆菌，经处理后分别注射到3 周龄的健康本氏烟草叶片中，在温度25 ℃、空气湿度为70%的条件下继续暗培养48 h。将已注射的烟草叶片制片后在激光共聚焦显微镜下镜检，观察叶片表皮细胞［21］。

1.2.5 酵母自激活活性验证

将MYB32基因两分别端引入SalI 和NdeI 酶切位点，设计引物（表2），并将MYB32基因编码区进行不同区域的分段研究，按照编码的氨基酸区域共拆分为6 个区段，分别构建到pGBKT7 载体上。将加入酶切位点的基因胶回收产物与pGBKT7 质粒同时进行双酶切反应，然后进行连接、转化，挑选正确的阳性克隆。提取pGBKT7-MYB32质粒，将其转入到酵母感受态细胞中。先将其涂布于SD/-Trp 筛选培养基中，在30 ℃条件下培养3~5 d，挑取单菌落验证后，将菌液点涂于加入X-α-Gal 的 SD/-Trp/-His 培养基中，相同条件培养数天，观察菌落是否有颜色变化。

表2 酵母自激活区域分段引物Table 2 Primers for self-activating regions of yeast

1.3 统计分析

使用Excel 统计数据的平均值和标准误差；运用T-Test 函数进行差异显著性方差分析，统计各组之间在0.01 和0.05 水平的差异显著性；使用GraphPad Prism 7.0 进行绘图。

2 结果与分析

2.1 MYB32 基因及其启动子的生物信息学分析

以小黑杨的cDNA 为模板，克隆MYB32基因的编码序列。以小黑杨的DNA 为模板经PCR 反应扩增克隆出MYB32基因上游1 500 bp 的启动子序列。NewPLACE 预测后，得知MYB32基因的启动子序列中除去核心启动子元件外，还包含其它胁迫应答元件（表3），涉及到赤霉素应答元件P-box，ABA 应答元件G-box，与干旱相关元件E-box、MYB-core 等（图 1），说明MYB32基因在植物应答各种胁迫过程中可能发挥重要作用［20］。

表3 MYB32 启动子克隆序列分析Table 3 Cloning sequence analysis of MYB32 promoter

图1 MYB32 启动子响应非生物胁迫（干旱、盐、ABA 胁迫）的顺式作用元件分布示意图Fig.1 Schematic diagram of cis-acting elements of MYB32 promoter in response to abiotic stress（drought，salt andABA stress）

2.1.1 理化性质分析

MYB32基因的 CDS 区全长 864 bp，使用 Ex-PASy ProtParam 预测分析，MYB32编码蛋白大小287 aa，其分子式为C1436H2225N397O450S14，相对分子质量32.699 69 ku，理论等电点5.85。根据其氨基组成得知，带负电荷残基总数为38，带正电荷残基总数为31；该蛋白不稳定指数为63.63，为不稳定蛋白；亲水性氨基酸数共134，占比约46.7%，疏水性氨基酸数共153，占比约53.3%，该蛋白的脂溶指数是70.31，平均亲水性系数GRAVY 为−0.688，小于0，认为该蛋白为亲水蛋白（图2A）。

2.1.2 蛋白质结构分析

使用Signal P 5.0 预测可知，该蛋白不包含信号肽；TMHMM 分析结果表明，该蛋白不包含跨膜结构域 ；SOPMA 显示该蛋白的二级结构由29.27%的α-螺旋、4.18%的β-折叠、64.11%的随机卷曲和2.44% 的延伸带所构成（图2C）。Swissmode 分析建模预测MYB32蛋白的三级结构（图2B）。

图2 MYB32 蛋白分析Fig.2 MYB32 protein analysis

2.1.3MYB32家族成员同源性关系分析

经BLAST 比对后，挑选了9 个与该基因同源关系较近的物种，输入MEGAX 软件对MYB32氨基酸序列与其比对（图3A），用Neighbor-Joining（NJ）邻接法构建系统进化树（图3B）结果显示，MYB32与毛果杨（Populus trichocarpa），簸箕柳（Salix suchowensis），银白杨（Populus alba）一类亲缘关系较近。与白栎（Quercus lobata），杨梅（Mo⁃rella rubra），橡胶（Hevea brasiliensis），木薯（Mani⁃hot esculenta），蓝果树（Nyssa sinensis），麻疯树（Jat⁃ropha curcas）等亲缘关系较远。BLAST 比对显示该基因同毛果杨亲缘关系最近达到97.21%。

图3 MYB32 家族成员同源性关系分析Fig.3 Homology analysis of MYB32 family members

2.2 MYB32 应答盐胁迫差异表达

在水培条件下，MYB32基因在根茎叶中的表达量无明显差异，而在150 mmol·L-1NaCl 的胁迫下该基因在不同时间点均明显上调表达，并具有组织特异性。在150 mmol·L-1NaCl 胁迫下，根茎叶的表达量变化均符合先升高再降低的趋势。其中根和茎的表达量均在胁迫的12 h 达到最大值，分别较对照升高了约11.4、4.8 倍。叶对盐胁迫不敏感，在6 h 时表达量约为对照组的2.4 倍（图4）。

图4 小黑杨MYB32 基因盐胁迫下不同组织在不同时间的相对表达量变化Fig.4 Changes of MYB32 gene expression in different tissues under salt stress at different times

2.3 亚细胞定位分析

将携带空载和重组质粒的农杆菌菌液经处理后注入健康的烟草叶片后，在激光共聚焦显微镜下观察到荧光反应的位置（图5）。经验证MYB32蛋白在细胞核中表达，与网站预测结果一致。

图5 MYB32 的亚细胞定位结果Fig.5 Subcellular localization of MYB32

2.4 酵母自激活活性验证

重组质粒MYB32-pGBKT7 转入到Y2H 酵母感受态细胞后，可在SD/-Trp 培养基中生长，且在加入了 X-α-Gal 的 SD/-Trp/-His 培养基中变蓝，说明MYB32基因具有自激活活性。后续将MYB32基因分为6 个片段，最终确定转录自激活的结构域为靠近C 端的片段（图6）。随着分段的缩小，发现第205~242 个氨基酸片段间，酵母细胞转化后可以在加入了X-α-Gal 的SD/-Trp/-His培养基上生长并发生颜色变化，而片段205~234 aa 在 SD/-Trp/-His/X-α-Gal 培养基不变蓝，这说明MYB32转录因子的自激活结构域在其蛋白的第205~242 位氨基酸之间。

图6 MYB32 自激活区域Fig.6 MYB32 auto-activation region

3 讨论

高等植物在不同水平上进化出了各种机制来适应多变的环境，包括胁迫信号传感和转导、特定转录因子的激活和相关基因的表达［22］。转录因子作为适应应激过程的重要组成部分，由不同的信号激活，负责应激反应基因的表达。有实验表明，MYB 转录因子家族在应对非生物胁迫（如干旱、低温、高盐及紫外辐射等）时，会发生特异性的表达变化。这说明它们在应对极端条件中发挥重要作用。

MYB 基因在植物谱系中的进化较为保守［23］，MYB 类转录因子具有1~4 个重复单元构成的MYB 结构域，MYB 的每个重复单元内部有 3 个 α-螺旋，第2 和第3 个螺旋构建成一个螺旋-转角-螺旋（HTH）的三维结构［24］。在酵母自激活试验中，我们发现MYB32基因可以在筛选培养基SD/-Trp/-His/X-α-Gal 上生长且菌落为蓝色，证明了该基因具有自激活活性。试验中找到的具有自激活活性的最短片段，为后续酵母相关试验提供了基础。对MYB32基因进行生物信息学分析，发现该基因编码的蛋白没有跨膜结构域、不具备信号肽，是一种不稳定的亲水蛋白。对其上游启动子进行预测分析后，发现该基因除去含有核心启动元件外，还涉及光胁迫应答元件、ABA 应答胁迫元件、赤霉素应答元件等多种胁迫应答元件。这说明该基因在植物应答各种胁迫过程中可能发挥了重要作用，参与了多种应答反应。在亚细胞定位实验中发现该基因编码的蛋白质在细胞核中表达，对后续基因功能、蛋白互作等研究提供基础。

MYB-TFs 分布广泛，是转录因子家族中含量最高、功能最强的一种，尤其R2R3-MYB 亚家族，在植物应答非生物胁迫的调控过程起了关键作用［5，22，25］。在小麦中TaMYB33、TaMYB19和Ta⁃MYB73参与盐胁迫反应，在拟南芥中的过度表达显著增强了它们对盐胁迫的耐受性［26］。Ta⁃ODORANT1是一个 R2R3-MYB 基因，在烟草中TaODORANT1过表达通过提高RWC、减少水分流失、降低 H2O2、MDA 和 Na+积累，增强了烟草的耐旱和耐盐性［22］。拟南芥中GmMYB12B2的过度表达提高了对盐和紫外线辐射胁迫的耐受性［27］。在水稻中，R2R3-MYB 型基因OsMYB91被证实与植物耐盐性和植物生长有关［28］，但关于杨树R2R3-MYB 基因应答盐胁迫的研究报道略显单薄。本研究中通过高浓度的盐胁迫证实了MYB32基因与抗逆相关，在高盐胁迫下其相对表达量呈先升高后降低的趋势，在不同组织中其相对表达量不尽相同，具有明显的组织特异性。

4 结论

本研究以小黑杨为研究对象，成功从小黑杨cDNA 中克隆出长度 864 bp 的MYB32基因，并由理化性质分析、进化关系和基因结构研究等方面入手，研究了MYB32基因组织差异表达和对耐盐度的差异表达。结果显示盐胁迫下MYB32具有明显的组织特异性，根中表达量显著高于茎叶。推测该基因与植物渗透调节相关，参与植物抗逆胁迫，为基因克隆、转基因和后续研究生物学机制的奠定了基础。