淫羊藿苷改善大鼠勃起功能障碍及大鼠阴茎海绵体纤维化程度研究

刘思巧，姚俊成，颜 天，王 磊，李玉涛，杨 祺，窦 科

(四川省医学科学院·四川省人民医院东院泌尿外科，四川 成都 610000)

勃起功能障碍(erectile dysfunction，ED)是患者无法正常勃起的疾病[1]。ED的患病率在全球呈现上升趋势[2]。多种因素与ED发生相关[3]。由于勃起过程主要由充血引起，血管性因素仍是ED发生中最重要的因素[4]。而在血管性ED的情况下，由于血流灌注减少，造成阴茎海绵体内血管及其周围组织破坏[5]。淫羊藿是淫羊藿属植物全草，在中国传统医学中，具有补肾阳的功用，其在人体中的主要活性成分是淫羊藿苷[6]。淫羊藿苷在人体内发挥多种作用[7～9]，包括改善组织纤维化程度[10]。为了确认ED发生时海绵体是否发生纤维化程度的增加，以及淫羊藿苷是否能改善海绵体纤维化，我们设计了本次实验。

1 资料与方法

1.1 一般资料2020年10月至2021年2月在四川省人民医院饲养的60只雄性SD大鼠，年龄8周，体重250～300 g，其饲料、饮水、饲养环境相同。实验器械：成都仪器厂产多通道生理记录仪，型号RM-6240E；匈牙利3DHISTECH公司生产数字切片扫描仪，型号Pannoramic 250；常州派斯杰医疗设备公司生产的全自动染色仪，型号RS36。

1.2 方法将60只SD大鼠通过简单随机抽样分为假手术组、模型组、他达拉非组及淫羊藿苷低、中、高剂量组各10只。除假手术组外，其余5组均采取结扎双侧髂内动脉的方式构建血管性ED大鼠模型[11]，在对大鼠麻醉满意后进入腹腔，寻找双侧髂内动脉后以丝线结扎其近端。假手术组仅在麻醉满意后进入腹腔，翻找查看双侧髂内动脉后，不作任何处理即缝合腹腔。完成手术后，对不同组大鼠给予不同的药物处理。其中假手术组和模型组不予药物处理，仅给予1 ml/d的生理盐水灌胃；他达拉非组给予0.8 mg/kg的他达拉非灌胃；低剂量组给予20 mg/kg的淫羊藿苷饲喂，中剂量组给予40 mg/kg的淫羊藿苷饲喂，高剂量组给予80 mg/kg的淫羊藿苷饲喂。以上饲喂连续持续30天。饲喂结束后，测量大鼠最大阴茎海绵体内压(ICPmax)后取得大鼠阴茎海绵体标本，对大鼠阴茎海绵体进行冷冻后切片，每份标本取得3份切片利用masson染色的方式对切片进行染色。染色包括脱蜡、固定液固定后，利用苯胺蓝染色液染色、苏木素染色液、丽春红品红染色液、天青石蓝染色液，随后利用磷钼酸溶液显色和弱酸性溶液酸化。染色结束后利用数字切片扫描仪对切片进行图像采集。

1.3 观察指标①ICPmax：作为测量大鼠勃起功能的指标。通过26G针头刺入大鼠阴茎海绵体根部时电刺激大鼠海绵体神经取得[12]。②纤维组织表达面积百分比：大鼠阴茎海绵体纤维组织表达面积百分比作为反映大鼠阴茎海绵体纤维化程度的指标。通过masson染色后数字扫描切片得到。

1.4 统计学方法采用GraphPad Prism 5.0系统。计量资料多组间比较采用方差分析，两两比较采用Tukey分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠勃起功能比较假手术组、他达拉非组、中剂量组、高剂量组高于模型组(P<0.001)；高剂量组高于他达拉非组(P<0.01)；低剂量组与模型组、高剂量组与假手术组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠ICPmax值比较

2.2 各组大鼠阴茎海绵体纤维化程度比较采用Image Pro Plus 6.0图像分析系统，对取得的大鼠阴茎海绵体切片标本进行测图像的光密度(IOD)和面积测定，计算纤维组织表达面积百分比。模型组阴茎海绵体纤维组织表达面积显著大于假手术组(P<0.05)。通过对6组大鼠的阴茎海绵体纤维组织表达百分比进行比较，模型组大于假手术组(P<0.05)，其余组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠阴茎海绵体纤维组织表达面积百分比比较 (%)

2.3 各组大鼠阴茎海绵体切片镜下观察通过40倍镜下观察，可见假手术组大鼠阴茎海绵体内胶原纤维组织疏松，染色样本光密度小(图1a)；模型组大鼠阴茎海绵体内胶原纤维交联非常致密，占据视野中的绝大部分(图1b)；他拉达非组大鼠阴茎海绵体内胶原纤维较疏松，染色样本光密度较小(图2a)；低剂量组大鼠阴茎海绵体内胶原纤维较致密，染色样本光密度大(图2b)；中剂量组大鼠阴茎海绵体内胶原纤维较疏松，纤维交联较疏松(图3a)；高剂量组大鼠阴茎海绵体内胶原纤维疏松，组织间隙大，染色样本光密度较小(图3b)。

图1 假手术组和模型组大鼠阴茎海绵体40倍镜下病理特征 a：假手术组；b：模型组

图2 他达拉非组和低剂量组大鼠阴茎海绵体40倍镜下病理特征 a：他达拉非组；b：低剂量组

图3 中剂量组和高剂量组大鼠阴茎海绵体40倍镜下病理特征 a：中剂量组；b：高剂量组

3 讨论

通过传统中药淫羊藿临床上对于治疗ED的启发，本文对于淫羊藿苷的活性成分淫羊藿苷在大鼠体内的作用做出了探究。通过查阅文献资料，确定了以双侧髂内动脉结扎的方式构造大鼠血管性ED模型，作为后续研究的基础。大鼠血管性ED模型也通过测量大鼠阴茎海绵体内压的方式得到验证。在后续的工作中，通过查阅文献确定了不同组别大鼠的药物饲喂浓度，并选择他达拉非这一临床常用改善勃起功能的药物作为阳性对照，作为后续治疗效果和机制的比较。通过对大鼠ICPmax的测量，可以对不同组大鼠的勃起功能进行比较。其结果可以提示，双侧髂内动脉结扎后大鼠的勃起功能显著降低，而他达拉非、中剂量淫羊藿苷、高剂量淫羊藿苷对于大鼠的勃起功能有显著的改善作用，低剂量淫羊藿苷对于大鼠的勃起功能改善效果不明显，而高剂量淫羊藿苷对于大鼠勃起功能的改善效果优于他达拉非。在进行大鼠阴茎海绵体纤维化程度的测量过程中，可以发现双侧髂内动脉结扎后，大鼠阴茎海绵体的纤维化程度显著增加，提示动脉灌注的减少能够导致海绵体纤维化增加，从而进一步限制血管的充盈和勃起的发生，为ED的发生和发展提供了新的思路。通过30天的药物饲喂，可以发现不同组别大鼠的阴茎海绵体纤维化程度存在一定的分布趋势，这一分布主要呈现为假手术组<高剂量组<他达拉非组<中剂量组<低剂量组<模型组。但通过两两比较，发现除假手术组与模型组之间的差别显著以外，其余的组间比较不具有明显的差别。这一差别可能与本次实验中对大鼠的灌药处理的方式和时间不同有关。通过查阅文献，可以发现在淫羊藿苷改善大鼠肝脏纤维化的实验中，其饲喂时间长达8周[13]。而在淫羊藿苷改善大鼠肾脏纤维化的实验中，采取了对大鼠进行淫羊藿苷静脉注射的方式给药，以达到更高的血药浓度[14]。因此，本实验药物处理时间较短，摄入方式需代谢转换，可能是导致本实验中能观察到淫羊藿苷在不同剂量组减少了阴茎海绵体纤维化的程度，但结果不显著的原因。在后续实验中，为探索淫羊藿苷对于大鼠阴茎海绵体有无去纤维化的作用，可适当延长饲喂淫羊藿苷的时间，在保证大鼠勃起功能不受衰老影响的前提下，进一步说明淫羊藿苷对大鼠海绵体纤维化的作用。

综上所述，双侧髂内动脉结扎能够显著破坏大鼠勃起功能；他达拉非灌胃和中剂量及高剂量淫羊藿苷灌胃能够显著改善血管性ED大鼠勃起功能；高剂量淫羊藿苷改善血管性ED大鼠勃起功能的效果，显著优于他达拉非改善血管性ED大鼠勃起功能的效果。模型组大鼠阴茎海绵体纤维组织面积显著大于假手术组阴茎海绵体纤维组织面积，提示双侧髂内动脉结扎后，阴茎海绵体内由于动脉灌注不足，可以造成阴茎海绵体的纤维组织增加，对ED的发病过程提出新的解释。他达拉非和各剂量淫羊藿苷的作用可以使得大鼠阴茎海绵体纤维面积不同程度下降，但效果不显著。