正交试验法优选参芪益气口服液提取工艺

李 萍,韦祖巧,曾 金,肖 萍,欧人豪

(柳州市妇幼保健院;广西科技大学附属妇产医院、儿童医院,广西 柳州545001)

我国每年有2 000多万产妇,约有70%存在着不同程度的产褥期缩复不良的情况[1]。超过70%的调查对象自报至少存在1种健康问题[2]。现代中医学通过研究显示,产后益气补血可以不同程度缓解和治疗妇女产后气血两虚的相关症状[3-7]。参芪益气口服液是柳州市妇幼保健院在研制剂,由黄芪、党参、当归、熟地黄等11味中药组成,主要用于妇女产后益气消炎,提高产妇免疫力,预防产后病等。方中黄芪补中益气、升阳固表,党参健脾益气、养血补气,为君药;当归血和营,助黄芪、党参益气生血,为臣药;山药、黄精平补肺脾肾三经,又能益气养阴,气阴双补,同为臣药;山银花清热解毒、宣表透邪、芳香避秽为佐药,甘草益气和中,调和诸药。参芪益气口服液是在我院中医专家多年临床经验的基础上,辨证施治总结出的有效方剂,通过益气补中,治疗妇女产后由气血两虚引起的产后气虚、盗汗、排尿困难等症,且该方在临床应用过程中发现可减少抗生素的使用。现代药理研究表明,黄芪能增强机体免疫功能,抑制炎症因子的分泌,还具有一定的抗菌作用[8]。党参具有免疫调节作用,可提高体液免疫功能[9]。

本研究采用正交试验法筛选参芪益气口服液中的11味药材的水提取工艺,以有效成分绿原酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和阿魏酸为主要指标测定含量,优选该制剂的最佳提取工艺,为该制剂的生产提供理论依据。

1 实验材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪(型号LC-20AT,日本岛津);电子分析天秤(型号FA1004,上海天平仪器厂);数控超声波清洗器(型号KQ-300DB,昆山市超声仪器有限公司);台式低速离心机(型号TDZ4-WS,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)。

1.2 试药

毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品(批号:111920-201606)、绿原酸对照品(批号:110753-201716)、阿魏酸对照品(批号:110773-201614)均购自中国食品药品检定研究院;参芪益气口服液样品由柳州市妇幼保健院药剂科制剂室提供;流动相用甲醇、乙腈为色谱纯,其他试剂均为分析纯,水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 绿原酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和阿魏酸含量测定

2.1.1 色谱条件 采用Agilent HC-C18(250 mm×4.6mm,5μm)色谱柱,乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)溶液为流动相,洗脱梯度(0~10 min,10%~10% A;20~60 min,10%~18%A),流速1.0m L/min,检测波长绿原酸、毛蕊异黄酮葡萄260nm(0~25min,45~60min),阿魏酸315nm(25~45 min),柱温30℃,进样量20μL,检测时间60min。在此色谱条件下,取“2.1.2”“2.1.3”项下溶液进行测定,所得色谱见图1。

图1 高效液相色谱

2.1.2 对照品溶液制备 分别精密称取绿原酸、阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量,加流动相溶解,制成母液浓度分别为2.008 mg/mL、0.464 mg/mL、0.896 mg/mL。精密量取绿原酸母液8.765 mL,阿魏酸母液0.732 mL、毛蕊异黄酮葡萄糖苷母液0.357mL,流动相定容至25.0 mL,摇匀,即得混合对照品溶液(浓度分别为绿原酸0.704mg/mL、阿魏酸0.013 6 mg/m L、毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.012 8 mg/mL),备用。

2.1.3 供试品溶液制备 精密量取参芪益气口服液提取原液1.0mL,流动相稀释定容至10.0mL,振摇,离心(3 600 r/min)5min,上清液用0.45μm微孔滤膜过滤,即得。

2.1.4 线性关系考察 分别精密吸取“2.1.2”项下混合对照品母液0.5 m L、1.0 m L、2.0 m L、3.0 m L、5.0 m L,用流动相定容至5.0 m L,得到系列浓度的混合对照品溶液,进样分析,记录峰面积。以峰面积Y对进样量X(μg)进行线性回归,得绿原酸的回归方程为Y=15.586X+15.526(r=0.999 8),线性范围70.4~704μg;阿魏酸Y=115 379X-18 029(R2=0.999 6),线性范围1.36~13.6μg;毛蕊异黄酮葡萄糖苷Y=75 598X+4 974.9(R2=0.999 4),线性范围1.28~12.8μg。表明绿原酸、阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷在一定范围内线性良好。

2.1.5 精密度试验 精密吸取参芪益气口服液样品(批号20051301),按“2.1.3”项下方法制备供试品,再按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6次,记录峰面积。结果,绿原酸、阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰面积的RSD分别为0.86%、0.75%、1.07%,表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 取同一供试品溶液20μL,按“2.1.1”项下色谱条件下分别于0 h、2 h、4 h、6 h、10 h、24 h进样,记录峰面积。结果绿原酸、阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、峰面积的RSD分别为1.15%、1.08%、0.61%,表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.1.7 重复性试验 取同一批样品,按“2.1.3”项下方法平行制备6个供试品溶液,分别进样20μL,记录峰面积,计算绿原酸、阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量。结果绿原酸、阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的RSD分别为1.47%、1.30%、1.69%,表明该方法的重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验 取同一批参芪益气口服液样品0.5m L,共6份,分别加入0.5m L已知浓度的混合对照品母液(含有绿原酸0.704mg/m L,阿魏酸0.013 6mg/m L,毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.012 8 mg/m L),加流动相定容至10.0 m L,振摇,离心,上清液用0.45μm微孔滤膜过滤,进样分析,结果绿原酸、阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷的平均回收率分别为99.44%、101.06%、98.00%,RSD分别为2.54%、1.57%、2.09%,表明本方法加样回收率良好。

2.2 提取工艺优选

本制剂采用正交试验法,对加水量(A)、提取时间(B)及提取次数(C)3个因素设计L9(3)4正交试验。因素水平表见表1。

表1 正交因素设计

按处方配比平行称取黄芪、党参等11味药材共9份,根据正交试验设计的条件进行提取,为提高煎煮效果,药材加水浸泡1 h后再进行煎煮。将正交试验得到的提取液过滤、合并、浓缩后,分别测定绿原酸、阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量,并进行多指标综合分析。

2.3 正交试验方法与结果

由表2直观分析可知,根据极差R大小确定影响因素主次为:提取次数>提取时间>加水量;根据K值可知,A2>A3>A1,B2>B3>B1,C2>C3>C1,初步可得最佳提取工艺为A2B2C2。

表2 正交试验结果

由表3正交试验结果方差分析可知,加水量(A)、提取时间(B)、提取次数(C)对综合评分均无显著性影响,故从省时节能、降低成本和对综合评分影响大小三方面考虑,选择A2B1C2因素水平。即最佳提取工艺为加7倍量水,提取2次,每次1h。

表3 正交试验结果方差分析

2.4 验证试验

为确定优选工艺的优劣和稳定性,按照处方量称取药材3份,加入7倍量水,浸泡30 min,沸腾后小火煎煮1 h,趁热过滤。滤渣加入7倍量水煎煮1 h,趁热过滤,合并两次滤液,浓缩至100 m L。按“2.1.2”项制备供试品,再按“2.1.3”项下色谱条件测定绿原酸、阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量。由表4结果可见,此工艺稳定可靠,重复性佳,合理可行,可用于参芪益气口服液的提取制备。

表4 工艺验证实验结果 (μg/m L)

3 讨论

在前期研究设计时,拟将干浸膏提取率纳入评价标准,但在研究过程中发现,其结果对综合评分影响不大,故未将其排在考察范围。

由于实验条件的限制,以及对照品货源的短缺,故将黄芪中的主要有效成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷、当归的主要有效成分阿魏酸、山银花的主要有效成分绿原酸作为含量测定指标,对参芪益气口服液的水提取工艺进行研究。本组方含11味药材,成分较复杂,样品的处理方法对本实验的结果影响较大,笔者分别用甲醇、50%甲醇、1%盐酸甲醇、流动相稀释,使用乙酸乙酯、丙酮等液液萃取法,以及固相萃取法,结果表明使用流动相(乙腈∶0.1%磷酸溶液=1∶9)稀释操作简单,得到的目标成分含量高且杂质少。

本实验通过L9(3)4正交试验,采用多指标评分法,对参芪益气口服液的制备工艺进行优选,最后得出其最佳提取工艺为加7倍量水,提取2次,每次1 h。经验证试验证实,该方法稳定、可靠。