王不留行药材中多糖含量测定研究

罗素菜,张海江

(1.浙江省中药研究所有限公司,浙江 杭州310053;2.淮阴工学院 生命科学与化学工程学院,江苏 淮安223003)

王不留行又名麦蓝菜,为石竹科植物麦蓝菜(Vaccaria segetalis(Neck.)Garcker)的干燥成熟种子,其植物资源丰富,除华南外,都有分布。王不留行为传统常用药,具有通乳、通淋、通经等功效,其化学成分主要有三萜皂苷、黄酮苷、环肽、类脂和脂肪酸、多糖等[1-2]。近年来我们通过对王不留行的化学成分及其生物活性进行研究,发现王不留行中的活性多糖为葡聚糖,由水溶性多糖和难溶性多糖组成,其中难溶性多糖所占比重较大,2种多糖均有显著的利尿通淋作用,在医用方面有很大的开发价值。

查阅相关文献及资料[3-7]可知,现阶段测定的多糖大多是水溶性多糖,主要采用紫外分光光度法测定,操作繁琐,重复性差,因此本研究运用HPLC-ELSD法对组成多糖的单糖进行定量分析,以期为其质量控制提供标准。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1100高效液相色谱仪(美国Agilent公司);6000型蒸发光散色检测器(美国奥泰公司);ME-204E型电子分析天平(瑞士梅特勒公司);DHG电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司);RE-52A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2 药物及试剂

王不留行药材分别采自河南、河北、甘肃、四川、云南、江苏,经浙江省中药研究所有限公司药材室鉴定为石竹科植物麦蓝菜Vaccaria segetalis(Neck.)Garcker的干燥成熟种子);葡萄糖对照品(中国药品检定研究院,批号110833-201205);乙醇(分析纯,成都市科隆化学品有限公司);乙腈(色谱纯,TEDIA);三氟乙酸(分析纯,麦克林);水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Prevail carbohydrate ES糖柱(250 mm×4.6 mm,5μm,Alltech);流动相:乙腈-水(75∶25);流速:1.0m L/min。理论塔板数按葡萄糖峰计算应不低于3 000。

2.2 供试品溶液制备

取本品粉末(过三号筛不过五号筛)约0.1 g,置圆底烧瓶中,加50 m L蒸馏水,加热回流2 h,趁热过滤(200目筛网),用20 m L热水分次洗涤滤渣及滤器,合并滤液及洗涤液,置圆底烧瓶中,加数滴消泡剂,旋转浓缩至近干,加约10m L蒸馏水,摇匀,缓慢加入无水乙醇,调至乙醇浓度为80%左右,醇沉过夜,离心,弃去上清液,沉淀用乙醇多次洗涤后,氮气吹干,用15 m L的1.0 mol·L-1三氟乙酸转移至20 m L顶空进样瓶中,充入氮气,封口,摇匀,置110℃烘箱水解2 h,取出,放冷,转移至圆底烧瓶中,水解液旋转蒸发(60～65℃)至近干,加乙醇重复上述步骤,直至三氟乙酸除尽,残渣加蒸馏水溶解并定容至50 m L量瓶中,摇匀,即得。

2.3 单因素考察

2.3.1 不同过滤目数考察 分别考察了100目和200目筛网过滤时对多糖含量的影响,结果表明200目筛网过滤的多糖含量高于100目的,原因可能是100目筛网过滤时有少量种皮过滤下去,导致水解不完全引起,故最终选择200目筛网过滤。见表1。

表1 不同过滤目数考察

2.3.2 不同乙醇浓度对醇沉的影响 操作步骤同“2.2”,乙醇浓度分别调为75%、80%、85%,结果表明乙醇浓度在75%~85%之间对多糖含量测定无显著性差异(RSD<3%),查阅2015版《中国药典》及相关资料,大多选用80%乙醇进行醇沉,故最终醇沉浓度选择80%乙醇。见表2。

表2 乙醇浓度比较 (%)

2.3.3 消泡剂的影响 由于多糖提取液中含有大量难溶性多糖,溶液呈糊状,在旋转浓缩过程中会出现很多泡沫,易造成提取液反冲现象,故需加入消泡剂。结果表明,消泡剂对多糖的测定结果无明显影响(RSD<3%),通过空白试验进一步证实了消泡剂对多糖含量测定无干扰。见表3。

表3 消泡剂的影响

2.3.4 提取时间比较 操作步骤同“2.2”,提取时间分别设为2、4、6h,结果表明,提取时间为2h时,提取已完全。提取时间为6 h时,多糖含量反而有所下降,故最终选择提取时间为2 h,数据见表4。

表4 提取时间比较

2.3.5 水解条件优化 分别考察酸浓度(0.5 mol·L-1、1.0mol·L-1、2.0 mol·L-1),水解温度(100℃、110℃、120℃),水解时间(1 h、2 h、3 h),以多糖含量为指标,确定最优条件,见图1。结果表明最优水解条件为酸浓度1.0 mol·L-1,水解温度110℃,水解时间2 h。

图1 水解条件优化结果

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性 按照“2.1”项下的色谱条件,精密吸取对照品溶液10μL,供试品溶液、空白溶剂各5μL,注入液相色谱仪,得到相应的色谱图。空白溶剂色谱中,在与对照品及供试品色谱相对应的保留时间处无色谱峰出现,证明王不留行中的其他成分对多糖测定无干扰,该测定方法专属性好。测定结果见图2、图3、图4。

图2 葡萄糖对照品高效液相色谱

图3 空白对照样品高效液相色谱

图4 王不留行药材高效液相色谱

2.4.2 线性关系 分别称取葡萄糖对照品适量,加水制成含葡萄糖1.809 2mg/mL的对照品溶液,作为对照品溶液A。精密移取对照品溶液A 3.5 mL置10 mL量瓶中,加水至刻度,作为对照品溶液B(0.633 2mg/mL)。精密移取对照品溶液A 1.0 mL置5m L量瓶中,加水至刻度,作为对照品溶液C(0.126 7mg/mL)。精密吸取对照品溶液A 15、10μL,对照品溶液B 5、10、15、20μL,以及对照品溶液C 10μL,注入HPLC仪,记录色谱图和峰面积。以对照品进样量的对数为横坐标(X),葡萄糖色谱峰面积的对数为纵坐标(Y)进行线性回归,绘制标准曲线,得到葡萄糖的回归方程为Y=0.579 8X-4.049 9,R2=0.994 6。结果表明,葡萄糖在1.267~27.140μg范围内线性关系良好。见表5。

表5 标准曲线制定

2.4.3 精密度试验 精密吸取“2.4.2”项下的对照品溶液B 10μL,注入HPLC仪测定,共进样6次,记录色谱图和峰面积。结果显示,峰面积RSD为0.96%,表明精密度较好。见表6。

表6 精密度试验

2.4.4 稳定性试验 取供试品溶液分别于配制后0 h、4 h、8h、12h、16h、20h、24h进样,按“2.3.1”项下线性方程计算多糖含量RSD为1.0%,表明样品溶液中多糖的含量在配制后24h内稳定性较好,因此样品溶液在配制后24 h内测定即可。结果见表7。

表7 稳定性试验 (%)

2.4.5 重复性试验 取6份王不留行药材粉末,按照“2.2”项下方法制备供试品溶液,精密吸取溶液5μL,注入HPLC仪测定,记录色谱图和峰面积。结果显示,王不留行药材中多糖含量为56.2%(RSD=1.3%,n=6),表明该方法重复性较好。结果见表8。

表8 重复性试验结果 (%)

2.4.6 加样回收率 取6份王不留行药材粉末0.05g,置100 m L圆底烧瓶中,向每只烧瓶中加入葡萄糖对照品溶液1.0 m L(23.79 mg·m L-1),按“2.2”项下方法制备供试品溶液。精密吸取溶液5μL,注入HPLC仪。记录色谱图和峰面积,计算加样回收率。结果显示加样回收率为95.3%~102.1%,RSD为2.7%,表明该方法回收率较好。结果见表9。

表9 加样回收率测定结果

2.5 多糖含量测定

取6批不同产地的王不留行药材(河南、河北、甘肃、四川、云南、江苏)粉末0.1g,每批2份,按“2.2”项下方法制备供试品溶液,精密吸取溶液5μL,注入HPLC仪。记录色谱图和峰面积,计算各供试品中多糖的含量。结果测得上述6个批号样品中多糖的含量分别为57.1%、58.3%、63.7%、37.0%、49.4%、8.6%(n=2)。

3 讨论

3.1 样品前处理方法

《中华人民共和国药典》2015版[8]对多糖提取先采用80%乙醇除杂,再回流提取,作者在测定王不留行药材多糖含量时,也对药典方法进行了考察,发现水提醇沉法优于药典方法(52.2% VS 38.5%)。另外,作者还比较了蒸发皿加热浓缩和旋转蒸发浓缩,发现旋转蒸发浓缩优于蒸发皿加热浓缩(52.2% VS 31.9%)。因此本研究采用水提醇沉-旋转蒸发浓缩作为样品前处理方法。

3.2 色谱条件考察

本研究考察了不同比例的流动相(乙腈∶水=75∶25、70∶30、80∶20)和不 同品牌 的色谱 柱(Hypersil氨基柱,Welch氨基柱,Alltech糖柱)对多糖含量测定的影响。结果发现使用氨基柱时,色谱图的基线噪音大,保留时间漂移,柱流失大,使用寿命短;而Alltech糖柱基线噪音小,柱效好,保留时间稳定,使用寿命长,故选择Alltech糖柱,见图5、图6、图7。另外,本项目前期研究确定王不留行多糖为均一性多糖,其一级结构为葡聚糖,多糖水解成单糖后,只有葡萄糖一个成分,不同比例的流动相对分离效果影响不大。结合保留时间及峰形情况,最终选择乙腈∶水=75∶25作为流动相。

图5 依利特NH2柱

图6 月旭NH2柱

图7 奥泰Prevail Carbohydrate ES柱

3.3 其他

近些年,随着色谱技术的不断发展,色谱法已成为分离、分析多糖的主流方法,其相较于比色法测定更具准确性。不过将多糖裂解成单糖是色谱法分析的前提,降解所得到的单糖通常不能直接进行HPLC分析,用UV检测器时需将样品衍生化再进行检测,操作繁琐。但根据单糖具有强极性及无紫外和荧光吸收特征,RID和ELSD检测器则可用非衍生化法。RID能分离不同单糖并测定其含量,但检测器的灵敏度较低,受温度影响较大;而HPLC-ELSD法能测定糖的种类和含量,具有分离效能高、选择性强、灵敏度高、使用方便、重复性好等优点。虽然目前没有录入《中国药典》,但是越来越多的研究表明此法应用前景较大,是一种值得推广的方法。